摘要：本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞, 从细胞学及分子生物学角度研究一氧化氮(NO)信号系统在AngⅡ介导的心肌肥大反应中的作用及机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、心房钠尿肽(ANP)的表达作为心肌肥大反应的指标,以硝酸盐及亚硝酸盐含量反映心肌细胞NO水平, 以免疫印迹法测定MKP-1蛋白表达, 以RT-PCR测定eNOS mRNA水平。结果发现: (1) L-精氨酸(L-Arg) 10、 100 μmol/L分别增加心肌细胞NO水平16%及31%, L-Arg (100 μmol/L)还可增加心肌细胞eNOS mRNA表达, 其作用可被NOS抑制剂L-NAME所抑制; (2) L-Arg (100 μmol/L)可降低AngⅡ(0.1 μmol/L)诱导的心肌细胞ANP mRNA表达水平和蛋白合成速率, 而在L-Arg处理之前用针对MKP-1的反义寡核苷酸转染心肌细胞, 蛋白合成速率明显增加, 可取消L-Arg的抑制作用,甚至超过AngⅡ组; (3) L-Arg (100 μmol/L)明显增加MKP-1蛋白表达, 比对照组增加225%, NOS抑制剂L-NAME及蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT-5823皆可抑制L-Arg诱导的MKP-1蛋白表达,分别抑制88%、 83%, 而AngⅡ能增加L-Arg诱导的MKP-1的表达, 较对照组增加365%, 增强了L-Arg的作用。以上结果表明, NO抑制AngⅡ介导心肌肥大反应的机制可能是通过激活PKG,促进MKP-1的表达, 从而增加MAPK去磷酸化实现的。心肌肥大是高血压最常见的并发症之一, 它既是高血压时心脏负荷过大引起心肌组织代偿性生长的结果, 也是心脏的病理性重构过程。临床流行病学资料表明,高血压合并心肌肥厚时猝死、 心律失常、 心绞痛、 心力衰竭等心血管疾病的发病率和死亡率明显增高, 严重影响高血压患者的预后,心肌肥大目前已被列为心血管疾病的独立危险因子［1, 2］。因此, 探讨心肌肥大的发生机制、 寻求合理的防治措施具有重要的理论及实践意义。

近年来的研究表明, 寻找信号传导通路的调控机制是揭示心肌肥大细胞分子机制的关键［3］。由于心肌细胞存在共同的分子效应信号,胞外多种刺激都可导致最终的心肌细胞肥大反应。现已明确, 压力超负荷及某些生长因子如血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)、 α1受体激动剂、内皮素-1(endothelin 1, ET-1)及某些细胞因子是导致心肌肥大的重要因子［4］。 亦有资料提示， 某些扩张血管、抑制蛋白合成的因子可能具有抑制心肌肥大的作用［5］。本研究室近几年的研究揭示一氧化氮(nitric oxide, NO)对心肌肥大具有明显抑制作用,可抑制多种致心肌肥大因子如AngⅡ、 ET-1等介导的心肌肥大反应。我们最近的研究表明, NO前体L-精氨酸(L-arginine, L-Arg)可抑制肾性高血压大鼠心肌肥厚,同时心肌组织的丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1, MKP-1)表达发生了重要的改变［6~8］。 为了进一步揭示L-Arg及NO抑制心肌肥大反应的机制,本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞, 以心肌细胞蛋白合成速率、 心房钠尿肽 (atrial natriuretic peptide, ANP)表达为心肌肥大反应的指标, 从细胞学及分子生物学角度研究NO信号系统在AngⅡ诱导心肌肥大反应中的作用及机制。

1材料和方法

1.1 试剂及仪器 TRIzol试剂盒购自Gibco公司; 兔抗鼠MKP-1单克隆抗体、 leupeptin、 apoprotinin、 PMSF、蛋白激酶抑制肽(其氨基酸序列为TTYADFIASGRRANA-IHD)均为Sigma公司产品; 化学发光增强剂(ECL)试剂盒(Phototope-HRP western Blot Detection Kit)为New England Biolab公司产品, 其它试剂均为国产分析纯。Revco超低温冰箱(美国); eppendorf 5417R型低温离心机(德国); Mini-ProteanⅡ电泳槽、电转印槽、 基因扩增(美国Bio-Rad公司); Mettler aE260型万分之一天平(瑞士); IBAS图像分析系统 (Kontron Elektronik公司, 德国); UVP-GDS8000 凝胶成像系统(英国); uV紫外分光光度计(英国CECIL2020)。

1.2 心肌细胞培养 按Simpson等［9］描述的方法培养新生大鼠心肌细胞。以0.06%胰蛋白酶分离1~3 d龄的Sprague-Dawley大鼠心室肌细胞,采用差速贴壁法纯化心肌细胞。在培养的前48 h, 在心肌细胞培养液中加入 0.1 mmol/L 5′-溴脱氧尿苷, 以抑制非心肌细胞增殖。然后换无血清培养液,72 h开始用于药物实验。

1.3 心肌细胞［3H］亮氨酸的掺入测定 调细胞浓度3×105个/ ml, 接种于24孔培养板上, 每孔1 ml。培养48 h后换为无血清培养基, 24 h后加入 37 kBq ［3H］亮氨酸及各种处理因子, 继续培养48 h。收集细胞于玻璃纤维素膜上, 以三氯乙酸固定,洗去游离的同位素标记物。滤膜烘干后置于含5 ml闪烁液的闪烁瓶中, 以LS3801液体闪烁仪(Beckman)测定放射强度。

1.4 用免疫印迹法测定eNOS和MKP-1蛋白表达 用各种干预因素处理心肌细胞不同时间后, 弃去培养瓶中的液体, 加入0.15 ml蛋白提取液, 其组成为(mmol/L):β-磷酸甘油 20, 苯甲酰胺 (benzamidine) 10, 焦磷酸钠 50, NaF 50, NaCl 50, EDTA 5, EGTA 5, na3VO4 0.2, HEPES 10 (pH 7.4), 0.1% Triton X-100, PMSF 0.5, aprotinin 0.1, leupeptin 0.02, 0.03% β-巯基乙醇。收集细胞提取物, 4℃离心(13000 r/min×10 min), 取上清液,按Bradford法测量蛋白浓度［10］, 调蛋白质浓度至200 μg/μl, 然后进行SDS-PAGE电泳, 上样量为25 μl,电印迹转移法将凝胶内的蛋白质转至硝酸纤维素膜上, 用含1%小牛血清白蛋白(BSA)的TBST溶液室温封闭1.5 h, 再分别与一抗:兔抗大鼠MKP-1单克隆抗体(稀释度为1∶5000)和兔抗大鼠eNOS单克隆抗体(稀释度为1∶4000), 4 ℃孵育过夜, 用TBST溶液洗脱3次,再与二抗: HRP标记的羊抗兔IgG抗体及羊抗小鼠IgG抗体(稀释度为1∶2000)室温孵育1 h, 以TBST溶液洗脱3次后与ECL试剂反应1 min, x光胶片压片曝光10 s～1 min, 以IBAS图像处理系统对胶片进行扫描测定感光区带的感光密度, 并进行积分处理。

1.5 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测eNOS mRNA、 ANP mRNA表达 (1)细胞总RNA的提取: 弃去培养瓶中的液体, 加入TRIzol试剂,按使用指南提取总RNA, 经紫外分光光度计检测纯度, OD260/OD280比值在1.8~2.0之间, 并根据OD260值计算样品总RNA浓度。(2)引物:内标设计为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate-dehydroge-nase, GAPDH),寡聚核苷酸引物序列根据Fort等［11］文献中所列: 上游 5′-CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCC-3′, 下游5′-TGA CCT tGC CCA CAG CCT TG-3′。可扩增出长度为443 bp的GAPDH cDNA片段; eNOS寡聚核苷酸引物序列根据Nadaud等［12］文献中所列:上游 5′-TTC CGG CTG CCA CCT GAT CCT AA-3′, 下游 5′-AAC ATG TGT CCT TGC TCG AGG cA-3′。可扩增出长度为340 bp (+268~+568 bp)的eNOS cDNA片段; ANP引物序列根据Lee等［13］文献所列: 上游 5′-GGC tCC TTC TCC ATC ACC AA-3′, 下游 5′-TGT TAT CTT CGG TAC CG-3′。可扩增出长度为458 bp(+4~+461 bp)的片段。以上引物寡聚核苷酸片段均由上海生工生物工程公司合成。(3)RT-PCR: TitanTM一管法RT-PCR试剂盒进行内标(GAPDH)、 eNOS、 ANP等相应片段的扩增, 总反应体积为50 μl, RT-PCR条件为: 55℃ 30 min; 94℃ 2 min; 94℃ 30 s、 45℃30 s、 68℃ 1 min, 10次循环; 94℃ 30 s、 45℃ 30 s、 68℃ 45 s (每循环递增5 s), 25次循环; 68℃ 7 min。(4) RT-PCR产物的检测和分析: 取RT-PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 用GDS凝胶成像系统拍摄打印实验结果, 电泳条带用IBAS计算机图像分析系统扫描分析。

1.6 NOx含量的测定 (1)样品制备: 弃去培养瓶中的液体, 加入冰预冷的0.3 mol/L高氯酸(冰浴), 收集细胞提取液于1.5 ml离心管中,12000 r/min, 4℃离心10 min, 取上清于另一离心管中, 待测。(2)亚硝酸盐/硝酸盐含量的测定: 按照亚硝酸盐/硝酸盐比色法试剂盒(Boehringer mannheim公司产品), 以亚硝酸钠、 硝酸钾为标准品, 制作亚硝酸盐/硝酸盐标准曲线, 求出相应的直线回归方程; 然后测定样品的光密度值,根据标准曲线方程求出相应的亚硝酸盐/硝酸盐含量; 最后根据各样品的蛋白定量, 求出每mg蛋白中亚硝酸盐/硝酸盐含量。

1.7 统计学处理 数据以mean±SD表示, 经SPSS软件进行统计检验, P＜0.05表示差异有显著性意义。

2结果

2.1 L-Arg对心肌细胞NO信号系统的影响

l-Arg处理心肌细胞, 可以增加NO代谢产物(硝酸盐及亚硝酸盐)水平, 且在10、 100 μmol/L浓度分别比对照组增加31%及16%, 提示L-Arg增加NO产量的作用与剂量有关,而L-Arg增加NO代谢产物水平可被NOS抑制剂L-NAME所抑制(抑制率为33%), 提示L-Arg的上述作用是通过心肌细胞NOS实现的; L-Arg(100 μmol/L)可增加心肌细胞eNOS mRNA表达, 该作用亦可被L-NAME所抑制; 另外观察到AngⅡ可减弱eNOS mRNA表达, 且能抑制L-Arg的作用。2.2 l-Arg对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应的影响L-Arg (100 μmol/L) 预处理心肌细胞, 可降低AngⅡ(0.1 μmol/L)诱导的心肌细胞ANP mRNA表达水平(图3)和蛋白合成速率, 从而抑制AngⅡ诱导的心肌肥大反应; 而在L-Arg处理前用针对MKP-1的反义寡核苷酸转染心肌细胞,蛋白合成速率可明显增加, 甚至超过AngⅡ组, 故MKP-1的反义寡核苷酸可对抗L-Arg对AngⅡ诱导的心肌肥大反应的抑制作用, 而且增强了AngⅡ的致心肌肥大作用。

2.3 L-Arg对心肌细胞MKP-1的影响

用L-Arg (100 μmol/L)处理心肌细胞, 可明显增加MKP-1蛋白表达(较对照组增加225%), 而NOS抑制剂L-NAME及蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT-5823亦皆可抑制L-Arg诱导的MKP-1蛋白表达,分别抑制88%、 83%, 提示L-Arg通过促进NO生成, 激活PKG而促进MKP-1的表达; AngⅡ能增加L-Arg诱导的MKP-1的表达,较对照组增加365%, 将L-Arg的作用又增强了162%, 提示L-Arg是