摘要：实验研究了一氧化氮 (nitric oxide, NO)对大鼠胸膜淋巴孔的调控和胸膜腔淋巴吸收的影响。NO供体和NOS (nitric oxide synthase)抑制剂分别经腹腔给药, 示踪剂 (台盼蓝)胸膜腔内注射后, 处死大鼠, 测定血清NO和台盼蓝浓度; 在扫描电镜下观察各组胸膜淋巴孔,用计算机图像处理, 统计学分析。结果显示, NO供体组血清NO浓度为49.34±18.47 μmol/L, 淋巴孔的面积和密度分别为6.80±1.13μm2和170.24±66.60 /0.1 mm2 ; NOS抑制剂组血清NO浓度为17.72±6.58 μmol/L,淋巴孔的面积和密度分别为5.72±1.54 μm2和61.71±12.73/0.1 mm2。血清NO浓度与淋巴孔开放的面积和密度成正相关(P＜0.05)。在胸膜腔给示踪剂后, NO供体组血清台盼蓝的浓度为74.68±33.67 mg/L, 与对照组比较有显著差异 (P＜0.05)。 提示, nO可以调控胸膜淋巴孔, 促进胸膜腔淋巴吸收。1975年Wang[1]首次报道了小鼠胸膜淋巴孔, 李继承[2]等亦发现了人体膈胸膜淋巴孔, 认为胸膜淋巴孔系胸膜下毛细淋巴管的开口,是胸膜间皮上的恒定结构, 与胸膜腔的物质吸收有关; 并指出, 胸膜淋巴孔参与了胸膜腔内的病理生理过程, 可能在胸腔积液的转归、 炎症的播散、 肿瘤的转移,以及矽肺的形成中有重要作用。近年来的研究亦证实胸膜淋巴孔可以引流胸膜内的积液、颗粒样物质和细胞成分等进入胸膜下淋巴管, 最终汇入脉管系[3~5]。然而,在生理状态下, 胸膜淋巴孔的开放数量和分布密度均较少, 故淋巴孔的开放和淋巴引流无疑受到某些因素的调控。Tsilibary[6]等认为,呼吸引起的膈肌舒张和收缩可影响腹膜淋巴孔的开合; 李继承[7]等的实验结果表明, 高浓度NO可通过舒张腹膜淋巴孔, 使腹透液吸收增加,且与腹膜透析失超滤有关。但目前尚无对胸膜淋巴孔和淋巴引流调控机制的报道。由于胸膜和腹膜在结构和功能上的相似性, 我们应用NO供体和NOS抑制剂,研究NO对胸膜淋巴孔的调控作用, 并使用示踪剂观察NO对胸膜腔淋巴吸收的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组 普通级SD大鼠24只, 体重200~250 g, 雌雄不拘, 由浙江医学科学院实验动物中心提供。随机分为对照组 (8只)、 NO供体组(8只)、 NOS抑制剂组 (8只)。

1.2 实验方法 NO供体组: 二硝基异山梨醇 (isosorbide dinitrate, ISDN) (Sigma公司)10 mg/kg腹腔注射; NOS抑制剂组: n-硝基-L-精氨酸甲酯 (N-nitro-L-arginine-methyl-ester, L-NAME) (Sigma公司) 200 mg/kg腹腔注射;对照组: 等量生理盐水腹腔注射。每组注射2次/日, 连续8 d。第8 d, 在3组大鼠分别腹腔注射ISDN、 L-NAME和生理盐水后30 min,胸膜腔注射2%台盼蓝0.4 ml, 20 min后断头取血, 分离血清, 置于-20℃冰箱备用; 同时取胸廓, 经PBS缓冲液充分漂洗后, 固定于4℃,2.5%戊二醛 (pH 7.4)液中。

1.3 NO浓度测定 按文献[8]方法, 取上清液50 μl, 加入等量Griess试剂, 混匀, 室温放置10 min, 于CliniBio128c全自动酶标仪570 nm处测定光密度 (A)值, 以NO-2的量表示NO含量, 并以NaNO2为标准品绘制标准曲线, 将A值换算为μmol／L。

1.4 台盼蓝浓度测定 用CliniBio 128c全自动酶标仪在620 nm处测定吸光度 (A)值, 并以正常大鼠血清配置台盼蓝标准品, 绘制标准曲线,将A值换算为mg/L。

1.5 扫描电镜制样与观察 取大鼠肋间部组织切成5 mm×5 mm, 用2.5%戊二醛和1%锇酸双固定, 2%单宁酸导电处理, 梯度乙醇脱水,醋酸异戊酯置换。用日立Eiko HCP~2型临界点干燥仪干燥, 日立Eiko IB~5型离子溅射仪镀金, 日立Stereoscan 260扫描电镜观察,加速电压为20 kV。

1.6 计算机图像处理 电镜图像视频信号经图像采样卡 (FlyVideo 98, 台湾)采样, 主要技术指标: (1) 图像分辨率为640×480×8 bits(黑白)和640×480×24 bits (彩色); (2) 图像采集时间为30帧/s; (3)显示图像为真色彩 (2563种色彩)。然后用Elescope1.0图像处理软件进行分析处理。该软件根据图像的灰度值, 可对采样后的数字图像进行自动和半自动分析, 自动生成待测淋巴孔周长、 面积以及密度等多项指标的数值。

1.7 统计分析 实验数据以mean±SD表示,组间差异用方差分析 (t检验), 并作Pearson相关分析。

2 结果

在扫描电镜下, 可观察到覆盖在大鼠肋胸膜上的两种形态的间皮细胞, 即扁平形间皮细胞 (flattened mesothelial cells)和立方形间皮细胞(cuboidal mesothelial cells)。前者细胞体积较大, 细胞表面有长而密集的微绒毛, 相邻细胞互相连续, 细胞轮廓不清,见图1A。后者细胞体积较小, 细胞表面微绒毛短而稀疏, 细胞明显凸向胸膜腔。胸膜淋巴孔仅位于相邻立方形间皮细胞之间, 多呈簇状分布,其形态呈圆形或椭圆形。淋巴孔由立方形间皮细胞的突起和胞体共同围成, 见图1B、 C、 D。

与对照组比较, NO供体组大鼠胸膜淋巴孔分布密度显著增加 (P＜0.05), 而NOS抑制剂组明显

表 1. NO对大鼠胸膜淋巴孔的影响

table 1. Effect of NO on the pleural lymphatic stomata of the rat (mean±SD)

groups [] Average area

(μm2) [] Average density

(/0.1 mm2)Control [] 6.36±1.81 []91.61±20.27NO donor []6.80±1.13#△[]170.24±66.60*NOS inhibitor []5.72±1.54△ []61.71±12.73* *P＜0.05 compared with control group; #P＜0.01 compared with NOS inhibitor group; △P＞0.05 compared with control group.

图 1. 大鼠肋胸膜表面间皮细胞扫描电镜图

fig. 1. Scanning electron micrographs of the mesothelial cells in the rat costal pleural. A: Flattened mesothelial cells (FM) without interstitial lymphatic stomata. ↑, microvilli. B: Cuboidal mesothelial cells (CM) and lymphatic stomata(S) of the control group. C: Cuboidal mesothelial cells (CM) and lymphatic stomata (S) of the NOS inhibitor group. D: Cuboidal mesothelial cells (CM) and lymphatic stomata (S) of the NO donor group. S, lymphatic stomata; ▲, particles of trypan blue; ↑, microvilli.

减少 (P＜0.05)。虽然NOS抑制剂组和NO供体组较对照组淋巴孔面积的差异没有统计学意义 (P＞0.05), 但NO供体组淋巴孔面积明显大于NOS抑制剂组(P＜0.01) (表1, 图1B、 C、 D)。 在扫描电镜下观察, 胸膜腔注入台盼蓝后,见台盼蓝颗粒被吸收进入淋巴孔内。NO供体组淋巴孔内的台盼蓝颗粒显著多于其余两组, 这一结果与血清台盼蓝浓度相一致 (表2, 图1B、 C、 D),表明NO促进了淋巴孔开放, 导致淋巴孔对胸膜腔内的物质吸收增加。

在腹腔内分别给予ISDN和L-NAME后, NO供体组大鼠血清NO浓度明显高于对照组 (P＜0.05), 而NOS抑制剂组则低于对照组 (P＜0.05)。相关性

表 2. 大鼠血清中NO及台盼蓝含量

table 2. Quantity of NO and the trypan blue in the rat blood serum (mean±SD)

groups [] NO

(μmol/L) [] Trypan blue

(mg/L)Control [] 27.67±9.84 [] 38.94±13.95NO donor[] 49.34±18.47* []74.68±33.67*NOS inhibitor [] 17.72±6.58*[] 25.13±15.17△ *P＜0.05 compared with control group; △P＞0.05 compared with control group.

分析显示, 大鼠血清ＮＯ浓度和胸膜淋巴孔开放的面积 (r=0.47, P＜0.05)、 密度 (r=0.57, P＜0.05)呈正相关。当胸膜腔注射台盼蓝后, nO供体组血清台盼蓝的浓度明显高于对照组 (P＜0.05), 而NOS抑制剂组血清台盼蓝的浓度虽然低于对照组, 但两者间的差异无统计学意义 (P＞0.05,表2)。同时, 胸膜淋巴孔分布面积 (r=0.50, P＜0.05)、 密度 (r=0.67, P＜0.01)与血清台盼蓝的浓度亦成正相关。

3 讨论

nO是NOS作用于底物L-Arg所产生的, 作为一种新型的细胞信使分子, 广泛参与机体心血管、 免疫和神经系统的生理和病理调节。最近, choe[9]和Soini[10]的实验表明, 病理状态下胸膜间皮细胞可以被诱导产生大量NO, 这些NO可能与石棉纤维引起的肺损害、胸膜间皮瘤和胸膜转移性腺癌的发生有关。Doboszynska[11]等还证实, 猪的子宫阔韧带淋巴孔聚集区立方型间皮细胞有NOS活性,并推测NO对淋巴孔可能有调节作用。

为证实NO对淋巴孔的调控作用, 本实验分别应用ISDN和L-NAME作为NO供体和NOS抑制剂。前者属于硝酸酯类药物, 通过体内代谢后产生NO, 作用较持久;后者与L-Arg结构相似, 当L-NAME过多时, 可以竞争抑制L-Arg生成NO的过程。实验结果发现, iSDN和L-NAME分别使大鼠血清NO浓度升高和降低, 表明这两种药物腹腔内应用, 可以稳定地改变大鼠血清NO浓度。在NO供体组, 随NO浓度的升高,胸膜淋巴孔的分布密度增加和淋巴孔开放面积的增大, 淋巴孔对台盼蓝的转归能力亦增强。然而, NOS抑制剂组的结果与NO供体组相反。我们的实验结果首次证实, nO具有对胸膜淋巴孔的调控作用, 能促进淋巴孔的开放, 加速胸膜腔内淋巴转归。目前认为, NO对胸膜淋巴孔的调控作用, 可能是通过NO激活鸟苷酸环化酶(GC), 使环磷酸鸟苷 (cGMP)升高, cGMP的升高则主要作用于cGMP依赖性蛋白激酶 (cGKs)使Ca2+依赖的细胞内传导信号蛋白磷酸化,细胞内Ca2+减少, 从而抑制Ca2+介导的肌球蛋白轻链磷酸化, 使细胞舒张, 淋巴