摘要：用脊髓(T8)中间外侧柱(IML)微透析方法结合高效液相色谱(HPLC)技术, 研究延髓头端腹外侧区(RVLM)微量注射血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ, 100 pmol, n=11)后脊髓IML氨基酸递质释放的变化。在RVLM 区微量注射ANGⅡ(100 pmol, n=11), 能显著增加(P＜0.01)脊髓(T8)内天门冬氨酸(ASP, 从4.75±1.01升至8.90±2.28 pmol/20 μl)和谷氨酸(GLU, 从18.99±8.64 升至73.88±29.26 pmol/20 μl)的释放。在同一RVLM部位注射losartan (10 nmol, n=8)可以显著抑制注射ANGⅡ引起的GLU释放升高反应(P＜0.05)。免疫荧光双标记结合共聚焦显微镜观察到RVLM内62%~91%的谷氨酸能神经元呈AT1 受体免疫阳性。此结果提示ANGⅡ诱发的脊髓内谷氨酸释放可能来源于RVLM 内AT1受体免疫阳性的谷氨酸能脊髓投射神经元。脑内血管紧张素Ⅱ(ANGⅡ) 在维持交感血管紧张性、 调节平均动脉血压(MAP)和心率(HR)中起重要作用。人们发现, 在与心血管功能相关的许多脑区,如延髓的孤束核(NTS)、 下橄榄核(IO)以及网状5期胡联等: 延髓头端腹外侧区血管紧张素Ⅱ对脊髓投射神经元氨基酸递质释放的调节生理学报 Acta physiol. Sin. 53卷结构(包括延髓头端腹外侧区RVLM), 均有1型血管紧张素(AT1)受体分布［1］。RVLM区微量注射ANGⅡ可引起MAP和交感神经放电活动(SNA)增加［2,3］; aT1 受体的特异性拮抗剂losartan可拮抗此升压效应和SNA的增加［4,5］。RVLM区注入ANGⅡ后, 该脑区谷氨酸释放增加［6］,但究竟是何种性质的神经元被激活, 并没有足够的实验资料。许多研究者曾致力于用电生理方法研究RVLM区内的ANGⅡ反应神经元, 但并未能得到［3,7］。长期以来,有人推论脑内ANGⅡ的升血压效应主要是通过儿茶酚胺系统神经元的活动［8~10］。但是现在越来越多的证据表明, RVLM区血管运动神经元很可能是谷氨酸神经元［11~13］。由于RVLM是维持交感缩血管紧张的基本部位,有下行投射达到脊髓中间外侧柱(IML), 所以本实验的主要目的是采用脊髓T8水平微透析技术结合高效液相色谱(HPLC)荧光检测, 观察RVLM区AT1受体功能对脊髓(T8) iML氨基酸释放的影响, 为证实RVLM区ANGⅡ对脊髓投射神经元的作用提供依据; 本实验还用形态学方法观察AT1 受体阳性神经元与谷氨酸能神经元的关系,为明确ANGⅡ是否能作用于心血管运动神经元提供形态学依据。

1材料和方法

1.1 动物准备雄性Wistar大鼠(250~300 g), 以乌拉坦(800 mg/kg, ip)与氯醛糖(35 mg/kg)混合腹腔麻醉。一侧颈总动脉插管记录动脉血压; 直肠温度维持在37.5±0.5℃。对动物行气管插管术, 自然呼吸。在解剖显微镜下,从背侧暴露第8节段胸髓(T8)。

1.2 RVLM区的微量注射麻醉动物取俯卧位, 头固定在定位仪上(Narishige, SN-3), 并前倾大约45°,以维持延髓表面呈水平位置。注射部位位于闩部向前1.5~1.9 mm, 中线向外侧1.7~1.9 mm, 自延髓表面向深部插入约3 mm即为RVLM区。注射量为0.1 μl。实验前, 先向RVLM区微量注射L-Glu (100 pmol, Sigma, USA), 有迅速升压反应的区域定为其它药物注射点。

1.3 T8段微透析小心地撕去T8段软脊髓膜, 自中线外侧450 μm处将一微透析探头(透析膜外径220 μm, 有效透析膜长度为0.5 mm, EICOM)垂直插入约900μm深处。探头尖端位于IML区域。 微透析灌流液为人工脑脊液(aCSF in mmol/L: NaCl 124, NaHCO3 25, KCl 3.3, kH2PO4 0.4, MgSO4 1.2, CaCl2 2.0, pH7.4), 灌流速度为2 μl/min。每份样品为20 μl,分别在微量注射药物前(以注射等量生理盐水作对照)以及注射药物后第一、 第二、 第三个10 min内各收集一份样品。所有氨基酸均购自Sigma公司。

实验后, 经大鼠左心灌注10% 福尔马林固定脑组织, 用冰冻切片机(CM1900, Leica)行脊髓和脑干切片(30 μm), 根据Paxions 和Watsons图谱确定微量注射和微透析的部位。

1.4 用HPLC-荧光检测法测定氨基酸含量用反相HPLC-荧光检测器(157型, Beckman)系统(System Gold GP-Ⅱ型, beckman)测定样品中氨基酸。色谱柱为C18 ultrasphere ODS反相柱(平均颗粒直径5 μm, Beckman)。 流动相组成: 62% 0.1 mol/L KH2PO4 (pH 6.0), 30%甲醇和3%四氢呋喃。梯度流速, 10 min内从1.0上升到1.98 ml/min。发射波长和激发波长分别为280和340 nm。检测器灵敏度置于RFU 0.01档。

1.5 免疫荧光双标记取4只雄性Wistar大鼠(250~290 g), 用水合氯醛腹腔麻醉(300 mg/kg ip), 经左心灌流150 ml生理盐水后,灌流250 ml 4%多聚甲醛(PA)。4% PA用0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液(PB, pH 7.4)配制。迅速取脑,并置于同样的固定液里(4℃)固定6~8 h, 然后依次转入20%、 30% 蔗糖(0.1 mol/L PB配制),于4℃浸透过夜。用小型冰冻切片机(Reichert-Jung, Germany)连续切片(厚30 μm)。取闩部向前1.5~1.9 mm段之脑片进行实验观察。

1.6 AT1受体和谷氨酸的双标记将冰冻切片依次在下列溶液中孵育: (1) 2%牛血清白蛋白(BSA)和0.2% triton x-100, 在37℃孵育30 min; (2) 小鼠AT1受体单克隆抗体(6313/G2, Gavin P.Vinson教授赠送, 1∶50), 先于37℃孵育1 h, 然后转入4℃孵育24 h; (3) Rhodamine-结合的兔抗小鼠IgG (Dako, Denmark, 1∶40) 中, 37℃孵育1 h;(4)抗谷氨酸的兔多克隆抗体(Sigma, USA, 1∶3?000)中, 37℃反应1 h; (5)异硫氰酸 (FITC)-结合的山羊抗兔IgG (Dako, denmark, 1∶40) 37℃反应1 h。

孵育反应后, 所有脑片在共聚焦显微镜(Leica, TCS-NT)下观察。有明显核形态的细胞为待检细胞。计数谷氨酸免疫阳性细胞,并计算有AT1受体表达的谷氨酸能细胞在谷氨酸细胞总数中的百分比。用同种非免疫血清代替一种或两种一抗后, 呈阴性反应。

1.7 数据统计微量注射和微透析实验数据用mean±SE表示, 用配对t-test作统计分析。P＜0.05表示有统计学显著意义。

2结果

2.1 RVLM区微量注射L-谷氨酸及AT1受体对MAP和HR的影响

wistar大鼠的基础MAP和HR(n=12)分别为96.37±13.26 mmHg和316.87±12.59 beats/min。RVLM区微量注射L-Glu(100 pmol, n=12)后, MAP迅速升高(ΔMAP=15.45±4.22 mmHg, P＜0.01);注射ANGⅡ (100 pmol, n=12)后, MAP逐渐升高(ΔMAP=15.29±5.2 mmHg), 并有显著性意义 (P＜0.01)。HR均无显著变化 (Ｐ＞0.05); RVLM区预注射losartan(10 nmol, n=9) 3~5 min后, 再于同一部位注射ANGⅡ (100 pmol), ANGⅡ的升压反应明显减小 (ΔMAP=6.47±3.41 mmHg, P＜0.05)。

2.2 T8脊髓IML微透析分析

2.2.1 IML内氨基酸的基础释放量将RVLM内微量注射0.1 μl生理盐水后10 min内的T8节段IML氨基酸的释放量定为基础释放水平(n=11): aSP 4.76±1.01 pmol/20 μl; GLU 18.99±8.64 pmol/20 μl; 谷氨酰胺(GLN) 22.84±15.21 pmol/20μl; 甘氨酸(GLY) 4.54±2.33 pmol/20 μl; 牛磺酸(TAU) 77.99±20.67 pmol/20 μl。

2.2.2 RVLM区微量注射L-Glu对IML氨基酸释放的影响RVLM区微量注射L-Glu (100 pmol, n=11)后第一个10 min内, 脊髓内TAU和GLN释放降低(分别为34.77±10.76和7.71±2.84 pmol/20 μl, P＜0.05); GLY释放增加至7.56±3.95 pmol/20 μl (P＜0.05); GLU和ASP释放有所降低,但无显著性意义(P＞0.05)。所有的变化在给药后第二个10 min 内恢复至注射前水平(P＞0.05)。

2.2.3 RVLM区AT1受体功能对IML氨基酸释放的影响RVLM微量注射生理盐水后再注入ANGⅡ (100 pmol, n=11)能显著提高(P＜0.01)脊髓内ASP (8.90±2.28 pmol/20 μl)和GLU (73.88±29.26 pmol/20 μl)释放水平; tAU (85.09±20.62 pmol/20 μl)释放有所升高, 但无统计学意义(P＞0.05); 所有变化至第三个 10 min恢复至基础水平(P＞0.05)。GLN和GLY释放无显著差异(P＞0.05)。RVLM区预先注射losartan (10 nmol, n=8)后再注射ANGⅡ(100 pmol), IML内GLU释放量为26.51±8.68 pmol/20 μl, 与生理盐水合并ANGⅡ注射组比较,其释放量显著降低(P＜0.01); ASP、 GLN、 GLY和TAU的释放无显著改变(P＞0.05)。GLU 释放在注射ANGⅡ后第三个10 min内恢复至基础水平(P＞0.05)。

2.3 AT1 受体在RVLM谷氨酸能神经元上的表达

在所有检测到的谷氨酸阳性神经元中, 在62%~91%的谷氨酸能神经元上有AT1受体共表达。

3讨论

rVLM 区微量注射ANGⅡ可使MAP升高, 此效应被AT1受体选择性拮抗剂losartan 抑制。此结果与以前的报道相似［3~5,14］。现已确认, RVLM内的前交感神经元发出下行纤维到达脊髓的IML。本实验证明,在RVLM内微量注射ANGⅡ后, IML内ASP和GLU的释放量明显增多, 而且谷氨酸释放能被AT1受体选择性拮抗剂losartan所拮抗。这说明:(1)外源性ANGⅡ注入RVLM可提高该区域内谷氨酸能脊髓投射神经元的兴奋性, 从而增加脊髓IML内兴奋性氨基酸如GLU 的释放; (2)该结果支持RVLM脊髓投射神经元是谷氨酸能神经元的推测［11,12,15］;(3)外源性ANGⅡ在RVLM的整合效应是交感兴奋, IML内以兴奋性氨基酸释放增加为主; 抑制性氨基酸GLY和TAU释放量的变化不显著,交感抑制系统活动变化不显著。我们在脊髓IML未测得GABA含量, 可能GABA在IML的含量甚微, 未达到该检测系统的灵敏度范围。事实上, 有人给RVLM区电刺激后,在脊髓IML区也未测得GABA变化［13］, 与我们的结果相似。由于RVLM区的脊髓投射纤维以交感兴奋性的为主［11,12］, 所以本实验在讨论ANGⅡ的升压效应时,更关心其对交感兴奋系统的影响。

在RVLM区注入ANGⅡ引起的IML内氨基酸释放反应与注入L-Glu引起的释放反应存在差异。本实验观