摘要：为了解胚胎时期巨核细胞增殖分化特有的内在机制, 本研究观察了在体外培养体系中, 胎肝源CD34+ 造血干/祖细胞在血小板生成素(thrombopoietin, tPO)作用下增殖分化特征与相关周期蛋白B1、 D1和D3表达及细胞内水平变化的关系。结果发现: (1)经12 d培养后, TPO使胎肝源CD34+细胞数从1×05个细胞/ml增加到13.12±4.06×105个细胞/ml, CD41+ 细胞增加到了95%, CD34+ 细胞下降到了3%,大部分细胞的DNA倍性为2 N, 少数为4 N, 无大于4 N巨核细胞, TPO对MegaCultTm-C胶原半固体培养体系中胎肝源CD34+ 细胞形成CFU-Mk集落产率的影响呈明显的剂量效应关系;(2)在整个培养期间, 周期蛋白B1表达逐渐增加, 并保持在一个高水平上, 培养后期, 高水平的周期蛋白B1出现在G1期细胞上;(3)周期蛋白D1和D3表达先增加, 培养后期细胞内水平下降, 且以G2期细胞为主。 该结果提示:(1)TPO通过上调周期蛋白B1和在所有细胞周期时限上调周期蛋白D1和D3表达, 促进巨核细胞祖细胞的增殖分化;(2)周期蛋白B1在G2+M期的持续高水平和周期蛋白D1和D3在G2+M期的水平下降, 可能导致胎肝源巨核细胞核内有丝分裂延迟或阻滞。在胚胎发育期间, 无论是胎肝造血还是骨髓造血, 巨核细胞形态均较小, 直到出生后数周,仍小于成人的巨核细胞［1～3］。我们以往的研究还发现尽管胎肝巨核细胞DNA倍性随胎龄的增加而增加,但直到出生前其DNA倍性同样低于成人［2］。这似乎提示胚胎发育时期, 巨核细胞的核内复制和DNA倍体化出现发育延迟或阻滞。体外研究表明与成人巨核细胞祖细胞相比,胎儿的巨核细胞祖细胞可产生较多的巨核细胞, 这些细胞形态上仍较小, 且DNA倍性也低于成人骨髓源巨核细胞［4,5］, 最近, 我们的研究发现胎肝CD34+造血干/祖细胞增殖的能力明显强于分化的能力［6］。该结果提示胎儿巨核细胞核内复制的延迟可能与其祖细胞的内在修饰特征有关。然而,胎儿巨核细胞核内复制延迟的机制目前尚不清楚。

有研究发现, 周期蛋白和周期蛋白依赖激酶 (CDK)在巨核细胞核内有丝分裂的调控上起重要作用［7～11］。然而, 周期蛋白和CDK在胎儿巨核细胞核内有丝分裂调控上所起的作用及其与胎儿巨核细胞核内复制延迟的关系目前全然不知［12］。本文对TPO作用下胎肝CD34+造血干/祖细胞的增殖分化与周期蛋白表达的关系进行了研究。

1材料和方法

1.1 材料与试剂IMDM培养液, 100×L-谷氨酸, 100×非必需氨基酸, 100×微量必需维生素,无Ca2+和Mg2+PBS和无Ca2+和Mg2+HBSS购自Gibco, 7.5%牛血清白蛋白V, alpha-thioglycerol (α-TG),木瓜蛋白酶, 多聚甲醛, Triton X 100, 戊二醛, RNAase, 2-巯基乙醇, EDTA, 氟化钠, 矾酸钠, 亮抑制肽,木瓜蛋白酶抑制剂和碘化丙啶购自Sigma公司。无细胞因子巨核细胞培养基(MegaCultTm-C without cytokines)和胶原溶液(collagen solution)购自加拿大Stem Cell Technologies Inc。血小板生成素(TPO)由美国Genentech inc.惠赠。抗人CD41a-FITC购自法国国际免疫公司, 抗人CD42a-FITC, cD61-FITC和CD34-PE及阴性对照抗钥孔血蓝素IgG2a-FITC和IgG1-PE购自美国BD公司。抗人周期蛋白B1与大鼠抗人周期蛋白D1和D3单抗购自美国Calbiochem公司。丙烯酰胺/N, n′-亚甲双丙酰混合物, 甘氨酸, 丙烯酰胺, SDS, TEMED, Tris, 过硫酸铵和DTT购自德国宝灵曼公司。ECL增强化学发光系统和硝酸纤维膜购自英国Amersham公司。MACS cD34+ Multi Kit购自德国Miltenyi Biotec公司。FITC标记鼠抗人周期蛋白B1、 D1和D3单抗购自美国Pharmingen公司。乏血小板AB血浆(PPP)按文献［7］的方法制备。胎肝来自妊娠16～20周净水囊引产的胎儿。

1.2 胎肝单个核细胞的分离及CD34+细胞的纯化无菌取出胎儿肝脏, 用眼科剪剪成小块, 研磨成单细胞悬液, 通过100目和200目的铜网, Ficoll(1.077g/ml)密度梯度离心分离单个核细胞, 悬于含1% BSA的PBS中待用。使用MACS磁珠分离CD34+ 细胞, 按100 μl磁珠对2×108个细胞比例将细胞与磁珠混合,冰浴30 min, 用MACS分离柱和磁铁分离CD34+细胞。被分离细胞悬于含10%PPP的IMDM中。

1.3 CD34+ 细胞的胶原半固体培养使用无血清无细胞因子MegaCultTm-C培养基,按厂商提供的方法并略加改良培养胎肝源CD34+细胞巨核细胞集落。将磁珠分离的胎肝源CD34+细胞以3.4×104个细胞/ml悬于MegaCultTm-C培养基中,向0.9 ml MegaCultTm-C培养基中, 加入0.1 ml细胞悬液, 0.1 ml TPO和0.6 ml胶原, 快速混匀, 加入24孔板,每孔加0.5 ml体系, 每组3个复孔, 37℃, 饱和湿度, 5% CO2条件下培养12 d。 TPO终浓度为0、 12.5、25、50、100和200 ng/ml,胎肝源CD34+细胞终浓度为2*#000个细胞/ml (1*#000个细胞/孔)。经12 d培养后, 按文献［5］的方法计数CFU-Mk集落。

1.4 CD34+ 细胞的液体培养将磁珠分离的胎肝源CD34+细胞以1×105个细胞/ml悬于巨核细胞培养体系中, 37℃, 饱和湿度, 5% cO2条件下培养0～12d。巨核细胞培养体系为含有20% PPP, 0.75% BSA和50ng/ml或100ng/ml TPO的强化IMDM。该IMDM为100ml iMDM强化加入1 ml 的100×L-谷氨酸, 100×非必需氨基酸, 100×微量必需维生素和10－3mol/Lα-TG。

1.5 膜表型分析培养细胞分别与CD41a-FITC、 CD61-FITC和CD42a-FITC孵育, 30 min。PBS洗涤,与识别不同于磁珠CD34单抗识别表位的CD34-PE单抗孵育30 min。用FACSort流式细胞仪对双标记细胞进行检测分析。

1.6 DNA倍性分析培养细胞与CD41a-FITC孵育30 min, 在PBS洗涤后, 用70%冷乙醇固定, 4℃冰箱过夜。用PBS洗去乙醇,加入含0.002% Triton X 100, 100U RNase和50μg/ml PI的染液进行DNA染色, 室温避光30 min。以FACSort流式细胞仪读取分析数据, fL1和FL2间的光谱重叠通过调节荧光补偿修正。在FL1对FL2-H点图上设门获取CD41+细胞5*#000～10*#000个。用LysysⅡ软件对巨核细胞的DNA倍性分布进行分析。

1.7 用免疫印迹法分析周期蛋白表达取5×106或1×107细胞, 用PBS洗涤2次, 以200μl裂解液 (50 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 0.5g/L SDS, 1 mmol/L DTT)裂解细胞, 离心收集上清。用改良的RIPA缓冲液 (含2 mmol/L EDTA, 50 mmol/L氟化钠,0.1 mmol/L钒酸纳, 1μl/ml亮抑制肽和1 μl/ml木瓜蛋白酶抑制剂)稀释, 测定蛋白浓度。每个样品取10 μg蛋白质在120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将蛋白转移至硝酸纤维膜上,分别使用抗周期蛋白B1, D1, D3单抗进行标记。膜彻底洗涤后, 用过氧化物酶标记的二抗进行标记, 使用增强化学发光系统检测反应蛋白, x线胶片显影。采用凝胶成像分析仪 (Gel Imaging and Image Analysis Instrument GDS8000, 英国UVP)对X线胶片上的条带进行峰下体积相对密度分析。

1.8 用流式细胞仪分析周期蛋白B1、 D1和D3表达与细胞周期的关系使用80%冷乙醇固定培养细胞,在－20℃冰箱中过夜。在无Ca2+和Mg2+HBSS中洗涤2次后, 在含0.25% Triton X 100的无Ca2+和Mg2+HBSS冰浴5 min。在无Ca2+和Mg2+HBSS中洗涤2次, 再使用FITC标记的周期蛋白B1、 D1和D3单抗分别标记细胞。洗涤后, 加入含0.002% Triton x 100, 100U RNase和50μg/ml PI的染液进行DNA染色, 室温避光, 30 min。以FACSort流式细胞仪读取分析数据, fL1和FL2-A间的光谱重叠通过调节荧光补偿修正。最后用CellQuest软件进行分析。

2结果

2.1 巨核细胞的增殖分化特性

tPO在胎肝CD34+ 细胞的增殖方面有明显的作用。TPO可以明显促进胎肝源CD34+ 细胞在胶原无血清半固体培养体系中形成CFU-Mk集落,而且呈现出明显的剂量效应关系。在50和100 ng/ml浓度时, CFU-Mk集落产率无明显差异; TPO浓度达到200 ng/ml时, CFU-Mk集落产率进一步增加。但经12 d培养后, 集落中已有部分细胞死亡。因此, 在液体培养体系中, TPO 使用的最适浓度为50和100 ng/ml。在液体培养体系中, TPO同样使胎肝源CD34+细胞快速地增殖, 细胞数从开始培养时的1×105个细胞/ml经12 d培养后增加到13.12±4.06×105个细胞/ml, CD41+细胞达到95%以上。用流式细胞仪分析血小板相关抗原(CD41a, CD42a, CD61)显示CD41a＋, CD42a＋和CD61＋细胞逐渐增加,表达造血干细胞相关抗原CD34的细胞逐渐减少到3%以下。在整个12 d的观察期间, 胎肝CD34+ 细胞源巨核细胞DNA含量以2 N和4 N为主, 无大于4 n巨核细胞。

2.2 周期蛋白表达特征

western blot分析显示，在TPO作用下, 胎肝源CD34+ 细胞在体外向巨核细胞的增殖分化过程中, 逐渐表达周期蛋白B1, 培养12 d后维持在一个较高的水平上。周期蛋白D1和D3在培养初期表达逐渐增加, 培养6 d后达到高峰, 而后又下降, 培养12 d时水平明显低于6 d的水平。

2.3 周期蛋白表达与细胞周期的关系

为进一步了解周期蛋白表达与细胞周期及巨核细胞DNA倍体化间的关系, 我们采用了DNA和细胞内抗原双标记技术对胎肝CD34+ 细胞源培养细胞进行了标记,流式细胞术分析显示双荧光标记和Western blot结果相同, 周期蛋白B1的表达随培养时间的增加而增加, 同时,周期蛋白B1表达有明显的自身特征。在培养中期(6 d), 周期蛋白B1主要表达在G2+M期, 而经12 d培养后,其主要表达在G1期。周期蛋白D1和D3表达具有类似的特征, 先升高后降低。在培养中期, 细胞周期各个时相均有表达,后期以G1期表达为主。值得注意的是新分离胎肝源CD34+ 细胞周期蛋白D3的表达已很明显, 且以增殖活跃的细胞为主。3讨论以往的研究和本文证实TPO可以明显地促进胎肝源CD34+细胞向巨核细胞增殖分化, 且在增殖方面的作用强于分化方面的作用, 而在核内有丝分裂方面几乎无明显作用。这说明胎肝源CD34+造血干/祖细胞向巨<