摘要：为了观察血管钠肽(vasonatrin peptide, VNP)对低氧作用时心成纤维细胞增殖的影响, 将分离纯化乳鼠心成纤维细胞, 随机分为4组:对照组、 低氧组(2%～3%)、 VNP组(10－８～10－６ mol/L)和VNP+低氧组。用MTT比色法、 ~3H-TdR掺入法观察细胞增殖情况,采用激光共聚焦方法研究VNP对细胞内钙浓度(［Ca2+］i)水平的影响。旨在探讨VNP对低氧刺激心成纤维细胞增殖的影响及机制。我们发现,低氧可以使培养的乳鼠心成纤维细胞MTT光吸收值(OD值)较对照组显著增高(P＜0.05)。VNP (10－６ mol/L)可以显著降低低氧刺激的心成纤维细胞MTT oD值和细胞内 ~3H-TdR掺入量的增高(P＜0.05)。对照组［Ca2+］i水平无显著差异, 低氧组［Ca2+］i水平显著升高, 而VNP (10－６ mol/L)能使升高的［Ca2+］i水平较对照组、 低氧组显著降低(P＜0.05)。结果表明, VNP能减弱低氧对心成纤维细胞生长的刺激作用,其机制可能与Ca2+等信号转导分子有关。低氧性心肌肥厚是高原性心脏病的主要表现之一,是低氧性肺动脉高压向心力衰竭发展的一个病理过程［1］。其形成过程与心脏负荷以及内皮素(ET-1)、血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)、生长因子等众多的因素有关［2～6］。低氧导致的交感神经兴奋性增强, 心肌细胞及心成纤维细胞自分泌、 旁分泌增强， 各种体液因素促进心成纤维细胞分裂增殖、分泌胶原及其它间质成分, 是低氧性心肌肥厚形成的可能机制之一［3～6］。降低细胞内Ca2+水平的心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)有抑制低氧致肥大的效应［7,8］。血管钠肽(vasonatrin peptide, VNP)是一种由27个氨基酸残基组成的人工合成多肽,是ANP和C型利钠尿肽(CNP)的嵌合体, 与ANP和CNP有高度的结构同源性, 因此, 可能有相似的药理效应。动物实验证明VNP可以降低肺动脉高压大鼠的右心室重量(反映右心室肥厚的指标)［9,10］,这可能是降低右心室后负荷的结果, 但是否有直接抑制心成纤维细胞生长的作用, 目前国内外报道很少。因此, 本实验的主要目的是观察VNP对低氧刺激的心成纤维细胞生长的影响及其可能的机制。

1材料和方法

1.1 材料 SD乳鼠(1～2 d): 由本校实验动物中心提供, 胰酶由DIFCO公司生产, 胶原酶、 EDTA、 DMEM培养基、 小牛血清为GIBCO公司产品, vNP由中国科学院上海生物化学研究所提供, 3HTdR由中国科学院上海核技术开发公司生产, Brdu为Sigma公司产品, MTT为西安华美试剂公司生产,酶联免疫分析仪和LS6500液体闪烁计数器为美国Beckman公司产品, 1H21A型Expired gas monitor为日本3A公司产品。

1.2 方法

1.2.1 主要药物配制VNP: 用生理盐水配成10－３ mol/L的原液, 4℃保存, 实验前用DMEM培养基稀释成工作液。DMEM培养基: 按说明书配制,用0.1 mol/L的盐酸调pH至7.2～7.4, 4℃保存备用。小牛血清: 56℃灭活30 min, －20℃保存。胰蛋白酶: 用生理盐水配成2.5 g/L的溶液, 4℃保存备用。EDTA: 用生理盐水配成0.4 g/L的溶液, 4℃保存备用。胶原酶: 用生理盐水配成1.5 g/L的溶液,4℃保存备用。MTT溶液:用生理盐水配制, 使用浓度为5 g/L, 用0.22 μm微孔滤器过滤除菌后分装, 4℃保存。2周内有效。闪烁液: PPO 2.5 g, POPOP 0.25 g溶于500 ml二甲苯中, 摇2～3 次/日, 3～5 d后使用。避光保存。

1.2.2心成纤维细胞培养于无菌条件下取出乳鼠的心脏, 剪碎, 以1.25 g/L胰蛋白酶及0.75 g/L的胶原酶消化成单细胞悬液, 离心(1*#000 r/min, 5 min), 用含0.1 mmol/L BrdU及100 ml/L灭活小牛血清的DMEM培养基重新悬浮, 贴壁90 min后将悬浮细胞吸弃,加入含100 ml/L灭活小牛血清的DMEM培养基传代至2～4代时, 将心成纤维细胞以5×107/L接种于96孔培养板(用于MTT比色或测~3H-TdR)或100 ml的玻璃培养瓶(用于传代), 之后, 移入37℃、 5% CO2培养箱中培养。若细胞贴壁并已伸展但未汇合 (subconfluent),用台盼蓝拒染法检查活细胞数超过95%, 可供以后实验用。

1.2.3 心成纤维细胞的鉴定在倒置显微镜下观察, 细胞呈梭形、 多角形, 细胞质透明, 细胞核明显变大, 呈椭圆形, 常含有2～3个核。用SABC法免疫组织化学染色,将心成纤维细胞以5×107/L接种于24孔培养板(预置于10 mm×10 mm盖玻片上), 待细胞爬片至接近融合时, 将24孔培养板内细胞以40 g/L的多聚甲醛固定(4℃、 20 min), 然后以15 g/L的正常羊血清孵育30 min, 以封闭组织中的抗体非特异性结合位点。将2 g/L BSA/0.5 g/L NaN3/PBS稀释的Ⅰ抗体 (分别为动物抗人FN、 抗波形蛋白、 抗血管平滑肌肌动蛋白) 加至玻片上, 4℃孵育48 h, 再依次在生物素化抗IgG(1∶400)和ABC液(1∶200)中分别孵育2.5 h (25℃)。最后用硫酸镍铵葡萄糖氧化酶法呈色, 苏木素复染, 经脱水透明后封片。

1.2.3细胞低氧培养方法将接种于培养瓶或培养板的细胞放置于一体积约7 L的真空干燥瓶中, 通入95% N2和5% CO2的混合气体, 以2 L/min,通气12 min, 使真空干燥瓶中气体浓度达到2%～3% O2和5% CO2。用Expired gas monitor分别检测真空干燥瓶中0, 6、 12、24、 48 h的气体浓度。在0～24 h，气体浓度可维持在2%～3% O2和5% CO2。

1.2.4 MTT比色法将心成纤维细胞以5×107/L 每孔100 μl接种至96孔板, 将不同培养板随机分为两组, 同一培养板又按竖排随机分为4组: 对照组、 vNP组(10－８～10－６ mol/L)及低氧组(2%～3%)、 以及VNP (10－８～10－６ mol/L)+低氧组。24 h后换为各种浓度的药物,置于低氧或常氧环境24 h, 以5 g/L, 每孔20 μl加入MTT。4 h后吸弃液体, 以每孔150 μl加入DMSO, 轻轻震荡10 min,用酶联免疫分析仪测光吸收值。

1.2.5 ~3H-TdR取对数生长期细胞将心成纤维细胞以5×１０７/L 每孔100 μl种至96孔板。 将不同培养板随机分为两组,同一培养板又按竖排随机分为5组: 对照组、 VNP组(10－８～10－６ mol/L)、 2.5×10－4 mol/L维拉帕米组及低氧组(20～30 ml/L)、 VNP (10－８～10－６ mol/L)+低氧组、 2.5×10－4 mol/L维拉帕米+低氧组。24 h后换为各种浓度的药物,每孔加入11.1 kBq ~3H-TdR, 置于低氧或常氧24 h, 多头细胞收集器收集细胞至玻璃纤维滤纸上, 烤干。将玻璃纤维滤纸置于闪烁计数管中,每管加入闪烁液0.5 ml, 用液态闪烁计数仪测定放射性。

1.2.6细胞内Ca2+的测定将心成纤维细胞以１０7/L, 每皿0.3 ml接种至中心有孔的培养皿上(培养皿底部中心钻直径为1.5 cm的孔, 将20 mm×20 mm盖玻片用中性树胶粘在培养皿底部)。待细胞贴壁后, 用台氏液洗涤细胞2次, 于37℃避光条件下用fluo-3/AM (10 μmol/L)荷载,50 min后用台氏液洗涤3次, 洗去残余染料。用共聚焦显微镜动态扫描细胞内钙的荧光强度变化。

1.2.7数据的统计学分析实验数据以mean±SD表示, 两组均数采用t检验, 多组间均数采用Origin5.0软件中单因素方差分析进行统计学处理。P＜0.05为相差显著, P＜0.01为相差非常显著, P＞0.05无显著差异。

2结果

2.1 VNP对低氧刺激的心成纤维细胞MTT OD值的影响

培养板在常氧时心成纤维细胞受不同浓度VNP作用后, MTT OD值与对照组无明显差异。放入低氧环境后, 低氧可以使心成纤维细胞MTT oD值增加。对照组OD值为0.30±0.02, 当放入低氧环境中OD值为0.35±0.04, 较对照组增加17%(P＜0.05)。VNP可以降低低氧刺激的心成纤维细胞OD 值。 当低条见下加入 10－7 mol/L VNP 时, OD 值为0.31±0.03,较低氧组降低11% (P＜0.05); 加入10－６ mol/L VNP时, OD值为0.30±0.02, 较低氧组降低14% (P＜0.01)。

2.2 VNP对心成纤维细胞内 ~3H-TdR掺入水平的影响

低氧使心成纤维细胞 ~3H-TdR掺入水平显著增高, VNP可显著降低低氧时 ~3H-TdR的掺入水平, 而且有剂量依赖性。对照组为(100±7)% cpm,低氧时为(129±14)% cpm, 当加入10－８、 10－７ mol/L和10－６ mol/L VNP后, 分别降为(105±8)% cpm、(95±14)% cpm (81±7)% cpm, 较低氧组分别降低18.6%、 26.3%及37.2% (P＜0.05)。当加入2.5×10－4 mol/L维拉帕米后, 低氧及常氧组的值均降低, 而且与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)。

2.3 VNP对心肌细胞内Ca2+水平的影响

低氧使心成纤维细胞内Ca2+水平显著升高, VNP可使升高的细胞内Ca2+水平降低. 对照Ca2+水平为(2.30±0.21)U,低氧时Ca2+水平为(4.45±0.36)U, 用VNP时Ca2+水平为(2.96±0.11)U, 显著小于低氧组(P＜0.05)。

3讨论

低氧刺激心成纤维细胞生长的机制还不是很清楚, 但低氧引起肺动脉高压, 其机械刺激可导致心成纤维细胞分裂增殖是低氧性心肌肥厚形成的可能机制之一［2］,低氧还导致交感神经兴奋性增强, 心肌细胞及心成纤维细胞自分泌、 旁分泌增强, 多种激素［3～6］促进心成纤维细胞分裂增殖和分泌胶原及其它间质成分,后者的作用可能起更重要的作用。这方面的研究正引起学者的注意和兴趣。

booz等报道, 在乳鼠心成纤维细胞, AngⅡ刺激的DNA合成至少有一部分是通过依赖Ca2+通道的［11］。Hou 等报道, 在人类AngⅡ刺激心成纤维细胞蛋白合成,是通过Ca2+敏感依赖PKC酪氨酸激酶途径的［12］。Angelino C等报道, l-型Ca2+通道阻断剂维拉帕米和尼莫地平可抑制去甲肾上腺素(NE)引起的心肌细胞 ~3H-亮氨酸和心成纤维细胞 ~3H-TdR掺入, 而且ANP、 S-nitroso-N-acetyl-D、 l-Penicillamine(SNAP)不能增强这种效应。在心肌细胞, Ca2+通道激动剂Bay-K8644可增强 ~3H-亮氨酸的掺入, 此效应可被ANP抑制。说明ANP可减弱NE引起的心肌细胞及心成纤维细胞增殖作用,这<