摘要：实验用胶原酶酶解法急性分离豚鼠心室肌细胞, 利用全细胞膜片钳的方法记录心室肌细胞的延迟整流钾电流(IK)、内向整流钾电流(IK1)和ATP敏感钾电流(IKATP)。采用低氧、无糖、高乳酸和酸中毒综合方式模拟缺血灌流,造成细胞的模拟缺血, 并在缺血的基础上继续用含100 nmol/L Ang Ⅱ灌流细胞, 观察AngⅡ对模拟缺血心室肌细胞钾离子通道的影响。实验结果显示：(1)模拟缺血时, IK明显减小; Ang Ⅱ能进一步抑制IK。(2)模拟缺血条件下, IK1受到抑制,并且以内向电流的抑制为主; Ang Ⅱ可加强对IK1内向电流的抑制, 而对部分外向电流则有增加的作用。（3）模拟缺血使IKATP 外向电流略有增加; AngⅡ则明显加强IKATP 外向电流, 此效应能被优降糖所阻断。血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)是肾素-血管紧张素系统(RAS)主要的活性调节肽。除全身性的RAS外, 心肌组织局部也能合成AngⅡ, 并以旁分泌的方式参与心肌结构和功能的调节[1, 2]。Ang Ⅱ对正常的心肌细胞, 包括窦房结细胞、心室肌细胞的多种离子通道起作用, 其中包括多种钾通道,如瞬时外向钾通道, 钙敏感性钾通道, 内向整流和延迟整流钾通道。据文献报道, Ang Ⅱ能使新生和成年大鼠的心室肌细胞的动作电位时程缩短, 自发收缩频率增加,产生正性的变时和变力作用, 并能增加传导速度, 有利于心肌的同步收缩[3]。

在心肌急性缺血时, RAS激活, Ang Ⅱ的合成和释放增加, 由此导致血管收缩, 外周阻力增加, 同时心肌收缩力增强, 从而维持血压的稳定和体液的平衡,可在一定程度上代偿受损的心功能; 缺血状态下心肌细胞的离子通道也发生性状的改变[4], 而AngⅡ对缺血心肌细胞离子通道的作用很少报道。本工作运用全细胞膜片钳方法, 用综合方式模拟豚鼠心室肌细胞缺血, 观察Ang Ⅱ对模拟缺血心室肌细胞钾离子通道的影响,以探讨Ang Ⅱ在心肌缺血中的作用及机制。

1材料和方法

1.1 动物豚鼠, 雌雄不拘, 200~300 g, 由上海医科大学动物部提供。

1.2 试剂Ang Ⅱ、 Ⅱ型胶原酶(collagenase type Ⅱ)、 K2ATP、 MgATP均为Sigma公司制品; HEPES、 MOPS、牛血清白蛋白(bovine serum album, BSA)为华美生物公司制品; 牛磺酸(taurine)等为国产分析纯。

1.3 溶液无钙MOPS液(mmol/L)：NaCl 100.0、 KCl 10.0、 MgSO4 5.0、 NaH2PO4 1.2、 Taurine20.0、 glucose 20.0、 MOPS 10.0 (用KOH调pH至7.2); 正常台氏液(mmol/L)：NaCl 137.0、 KCl 5.4、 mgCl2 1.0、 CaCl21.8、 HEPES 10.0、 glucose 10.0 (用NaOH调pH至7.3); 记录钾电流的细胞外液(mmol/L)：NaCl137.0、 KCl 5.4、 MgCl2 1.0、 HEPES 10.0、 glucose 10.0 (用NaOH调pH至7.3); 记录钾电流的电极内液 (mmol/L)：KCl140.0、 MgCl2 0.5、 EGTA 2.0、 HEPES 5.0、 K2ATP 4.0 (用KOH调pH至7.2); 模拟缺血液(mmol/L)：NaCl117、 KCl 5.4、 CaCl2 1.8、 MgCl2 1.0、 NaHCO3 3.8、 NaH2PO4 0.9、 乳酸钠 20、 95% N2和5% cO2混合气体饱和, pH 6.6。

1.4 心室肌细胞的分离将豚鼠麻醉后快速开胸取出心脏, 经主动脉插管,连于Langendorff灌流装置上, 行恒压逆行灌流。灌流液均用100% O2 饱和,灌流系统温度维持在37℃, 流速为8~10 ml/min。先用无钙MOPS液灌流5 min, 再用含0.03%的Ⅱ型胶原酶, 50 μmol/L Ca2+和1% bSA的低钙MOPS液灌流约5 min, 至心脏体积膨大, 流出液变粘稠, 取下心脏, 将心室肌剪下, 置于含100 μmol/L Ca2+和1% BSA的37℃低钙MOPS液中剪碎,用开口光滑的吸管轻轻吹打, 孵化10 min, 取细胞悬液逐步复钙, 至钙浓度为1.0 mmol/L, 最后用200目细尼龙网过滤,即可得到50%~60%呈杆状且横纹清晰的耐钙心室肌细胞。在室温下保存备用, 活性可保持10 h。

1.5 膜片钳全细胞记录实验采用标准膜片钳全细胞记录方法[5]。玻璃微电极充灌电极内液后, 电极电阻为2~4 MΩ, 给予适当负压吸引,使电极与细胞表面形成高阻抗封接(giga-seal), 继续加大负压, 吸破细胞膜, 形成全细胞记录。信号经Ag/AgCl电极引导, 膜片钳放大器(Axon200B)放大, 电流的记录采用电压钳制方式。所有数据均以Mean±SD表示, 用配对t检验进行统计分析。

2结果

2.1 Ang Ⅱ对延迟整流钾电流(IK)的影响

将保持电位置于－40 mV, 以10 mV为阶跃, 自－40 mV去极化至50 mV, 得到一组IK值, 以电流对测试电压作图, 可得到IK的电流-电压(I-V)关系曲线。

以正常台氏液灌流下的电流值为对照, 外向电流随去极化而逐渐增强。 模拟缺血液灌流5 min后, IK 值稳定。实验观察到, 各测试电压下的IK均降低,与对照相比, 在20~50 mV时IK的变化有显著性差异(P＜0.05~0.01, n=7)。在50 mV指令电压下, IK从478.1±152.4 pA降至348.3±143.6 pA, 降低27.2±5.8%(Ｐ＜0.01)。继续以含100 nmol/L Ang Ⅱ的模拟缺血液灌流5 min后, 各测试电压下的IK进一步降低,在－20~50 mV各个指令电压下, 有显著性差异(Ｐ＜0.05~0.01, n=7)。在50 mV指令电压下, IK从348.3±143.6 pA降至232.4±141.0 pA, 降低33.3±1.8% (Ｐ＜0.01)。

2.2 Ang Ⅱ 对内向整流钾电流(IK1)的影响将保持电位置于－40 mV, 给予－100~30 mV、 阶跃10 mV、 持续300 ms的指令电压, 得到一组稳态电流值, 且不随时间而改变, 即IK1, 表现出内向整流的特性。以电流对测试电压作图,可得到呈N型的IK1电流-电压关系（I-V）曲线。IK1的反转电位大约为－70 mV。

以正常台氏液灌流下的IK1为对照, 稳定后用模拟缺血液灌流5 min后, 电流变化达到稳态, 直至20 min。结果显示IK1的内向和外向电流均减小,与对照组比较, 在－100 mV电压下, IK1由－1373.1±396.24 pA降至－1101.9±235.9 pA,降低19.8±40.5%（P＜0.05, n=6）; 在－90 mV电压, 由对照的－868.5±306.5 降至－658.3±188.5 pA,降低24.2±38.5%（P＜0.05, n=6）。反转电位无明显变化。外向电流的减小无显著性差异（P＞0.05）。继续以含100 nmol/L Ang Ⅱ的模拟缺血液灌流5 min后, IK1的内向电流继续减小, －100 mV电压下的内向电流由模拟缺血时的－1101.9±235.9 pA降至－938.83±207.3 pA, 降低 14.8±12.1%（P＜0.05, n=6）。反转电位无明显变化。外向电流的改变统计学无显著性差异（P＞0.05）。

2.3 AngⅡ对ATP敏感钾电流(IKATP)的影响将保持电位置于－80 mV, 测试电压从－80 mV去极至+60 mV, 持续300 ms, 以失活内向电流;然后用斜坡电压刺激, 以40 mV/s的速率, 从+60 mV复极至－100 mV, 引导出背景电流, 用模拟缺血液灌流5 min后, 外向电流有增大的趋势,但与对照组相比无显著性差异(n=5, P＞0.05); 继续用含100 nmol/L Ang Ⅱ的模拟缺血液灌流5 min, 电流继续增大, 用30 μmol/L优降糖(glibenclamide, aTP敏感钾通道的特异性阻断剂)能阻断这部分外向电流, 证明此外向电流系IKATP 。以电流对电压作图, 可得到IKATP的电流-电压关系曲线(I-V)。在+60~－70 mV测试电压范围内, 显示明显增强的外向电流(Ｐ＜0.05~0.01, n=5)。在60 mV测试电压下, 电流由对照组的567.85±258.36 pA增至缺血时的635.9±289.53 pA和给予Ang Ⅱ时的1001.45±407.10 pA, 分别增加11.98±12.07%(n=5, P＞0.05) 和57.01±40.6%(n=5, p＜0.05, ischemia+Ang Ⅱ vs ischemia)。

3讨论

iK是复极化的限速电流, 对动作电位的时程和平台期有很大的影响[6]。抑制该电流可使复极延迟, 并使动作电位时程延长。本实验观察到在模拟缺血条件下, IK明显受到抑制,与文献报道相符[4]。但Barry等描述缺血时动作电位时程并无延长, 反而缩短[6], 说明在缺血状态下,决定和影响动作电位时程的尚有其它因素。如生理条件下发挥作用的K+ 通道在心肌缺血时受到抑制, 而一些正常情况下不开放的K+ 通道则被激活, aTP敏感钾通道就是其中之一, 即所谓的“损伤电流” [7] 。IKATP 的激活可能是引起缺血时动作电位时程缩短的主要原因[4, 8]。

本实验结果观察到, 在缺血的基础上Ang Ⅱ能进一步抑制IK, 其意义可看作是缺血的代偿反应。因为缺血时由于钠-钾泵受到抑制而致细胞外高钾[9],细胞易去极化; 抑制IK, 使K+ 的外流减慢, 减少细胞内K+ 的过度丢失, 从而能减少动作电位时程缩短的幅度。

iK1为背景钾电流, 属电压依赖性钾通道, 这种通道的整流作用有利于维持细胞的静息电位; IK1还在心肌动作电位的复极末期起作用,与动作电位形状的维持有关。本实验在模拟心肌缺血时发现IK1明显受到抑制, 提示缺血能使心室肌细胞静息电位减小, 这种改变所导致的结果,可能取决于缺血的程度和膜电位减小的程度。缺血所致的心肌电生理特性的改变最终是各类离子通道变化的综合反应。

本实验结果表明, 在缺血的豚鼠心肌细胞, Ang Ⅱ能进一步抑制IK1。并且模拟缺血和Ang Ⅱ主要是对内向部分电流的抑制为主,对于外向电流虽有减小的趋势, 但无显著性差异, 这可能与此时有病理状态下的外向K+ 电流的增加有关, 这部分电流与IK1的外向电流部分重叠,从而抵消了部分IK1外向电流的抑制效应, 因为在缺血的状态下, 许多生理状态下不开放的离子通道会被激活, 其中包括乙酰胆碱敏感钾通道, aTP敏感钾通道等[10～12]。

本实验采用低氧、无糖、高乳酸和低pH综合方式的模拟缺血液灌流细胞, 在此模拟缺血状态下, IKATP有增大的趋势, 但统计学无显著性差异,原因可能在于此模拟缺血液所造成的缺血程度尚不足以完全激活KATP 通道。在此缺血的基础上, Ang Ⅱ可使KATP通道开放, IKATP明显增大,提示在心肌缺血时Ang Ⅱ是有利于KATP通道开放的。