摘要：采用Western blot、 氚-胸腺嘧啶(~3H-TdR)和氚-亮氨酸( ~3H-Leu )掺入等技术和方法, 用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和血管紧张素-(1-7)［Ang-(1-7)］刺激大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs), 观察和分析Ang-(1-7)对VSMCs增殖及蛋白激酶C (PKC)和胞外调节蛋白激酶(ERK)表达的影响。Ang-(1-7)能明显抑制基础和AngⅡ刺激下的VSMCs PKC-ζ和ERK1/2蛋白表达(P＜0.01或P＜0.05), 减少~3H-TdR和~3H-Leu掺入量(P＜0.01或P＜0.05)。结果提示, Ang-(1-7) 对VSMCs增殖有抑制作用, 这可能与影响PKC-ζ和ERK1/2蛋白表达有关。血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖是高血压、 动脉粥样硬化及球囊扩张术后血管再狭窄的重要原因。Ang Ⅱ可通过PKC-ERK级联反应介导细胞增殖和分化［1］。新近的研究表明［2,3］,血管紧张素多肽家族的成员Ang-(1-7)是Ang Ⅱ的内源性拮抗因子, 可以抑制Ang Ⅱ介导的VSMCs增殖,但有关其作用的信号转导机制尚不十分清楚。本文应用Ang Ⅱ和Ang-(1-7)刺激VSMCs, 并检测PKC-ζ、 eRK1/2蛋白表达及~3H-TdR和~3H-Leu掺入, 观察Ang-(1-7)对VSMCs生长的影响, 并对其相关信号转导机制进行探讨。

1材料和方法

1.1 材料M199培养基(GIBCO)、 Ang Ⅱ和Ang- (1-7) (Sigma公司)、 苯甲基磺酰氟(PMSF, B.M公司)、兔抗鼠ERK1/2单克隆抗体(Santa Cruz公司)、 兔抗鼠PKC-ζ多抗和辣根过氧化物酶标记兔Ⅱ抗(北京中山生物技术公司)、硝酸纤维膜和化学发光试剂(NEC公司)、 氚-亮氨酸(~3H-Leu 37 MBq/ml, 中国科学院上海核技术开发公司)以及氚-胸腺嘧啶(~3H-TdR 37 mBq/ml, 北京原子能科学研究院)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组将培养的VSMCs分为４组, 分别为Ang Ⅱ、 Ang-(1-7)、 Ang Ⅱ+Ang-(1-7)及对照组。

1.2.2 VSMCs培养无菌条件下分离Wistar大鼠的胸主动脉, 按酶消化法［4］培养VSMCs。α-actin (免疫组化)鉴定VSMCs,其纯度达95%以上, 选择生长良好的第4~7代VSMCs用于实验, 消化的VSMCs配制成2×105cells/ml的悬液备用。

1.2.3 ~3H-TdR和~3H-Leu掺入的测定将VSMCs悬液接种到24孔板(1 ml/well), 放入CO2培养箱, 48 h后换上无血清培养基继续培养24 h, 按实验分组加入Ang Ⅱ(10－9~10－5mol/L)、 Ang-(1-7) (10－９~10－５ mol/L)、 ang Ⅱ(10－７ mol/L)+Ang-(1-7) (10－９~10－５ mol/L), 对照组不加药物, 各组均加入~3H-TdR (终浓度为37 MBq/ml),24 h后收集各孔细胞, 液闪记数, 用~3H-TdR掺入反映VSMCs DNA合成速率, 重复6次。~3H-Leu终浓度为185 MBq/ml,其余同~3H-TdR掺入的测定。

1.2.4 Western blot将VSMCs悬液接种于培养皿中, 24 h后换上无血清培养基培养24 h, 按实验分组加入Ang Ⅱ(10－７ mol/L)、 Ang-(1-7) (10－７ mol/L)、 Ang Ⅱ(10－７ mol/L)+Ang-(1-7) (10－７ mol/L),对照组不加药物。剌激15 min后, 按Bradford′s［1］提取蛋白并定量, 用聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白(上样量为40 μg总蛋白),将蛋白电转到硝酸纤维膜上, 封闭后加一抗(1∶2?000稀释)、辣根过氧化物酶标记二抗(1∶1?000稀释), 用化学发光试剂增强反应, X光片压片曝光,凝胶成像系统分析结果, 重复3次。

1.2.5 统计数据以mean±SD表示, 组间进行t检验, P＜0.05为差异显著。

2结果

2.1 ~3H-TdR和~3H-Leu掺入

与对照组相比, Ang Ⅱ呈浓度依赖性地显著增加VSMCs ~3H-TdR 和~3H-Leu掺入(P＜0.01或P＜0.05); Ang-(1-7)呈浓度依赖性地抑制~3H-TdR和~3H-Leu掺入(P＜0.01或P＜0.05); 与Ang Ⅱ (10－７ mol/L)组相比, Ang Ⅱ+Ang-(1-7) 组~3H-TdR和~3H-Leu掺入量明显被抑制(P＜0.01或P＜0.05), 亦呈量效依赖关系。

2.2 PKC-ζ和ERK1/2蛋白表达

western blot显示, VSMCs表达PKC-ζ蛋白, VSMCs同时表达ERK蛋白的两种同型体, 即ERK1和ERK2, 分子量分别为42 和44 kD。凝胶成像系统分析表明, Ang Ⅱ刺激VSMCs后, PKC-ζ和ERK1/2蛋白表达明显增高, 与对照组相比差异显著(P＜0.01); Ang-(1-7)剌激VSMCs后PKC-ζ和ERK1/2蛋白表达明显小于对照组(P＜0.01或P＜0.05); 与Ang Ⅱ组相比, Ang Ⅱ+Ang-(1-7) 组PKC-ζ和ERK1/2蛋白表达明显被抑制(P＜0.01或P＜0.05)。

3讨论

ang-(1-7)是由七个氨基酸组成的血管紧张素多肽家族的成员, 作为Ang Ⅱ的内源性拮抗因子, 对VSMCs生长发挥重要的调节作用。Freeman等［3］报道Ang-(1-7)浓度依赖性地抑制血清、 ang Ⅱ和血小板源生长因子(PDGF)刺激的VSMCs ~3H-TdR掺入; Ang Ⅱ通过血管紧张素Ⅰ型受体(AT1R)发挥效应, 但Ang-(1-7)与其机制不同,其作用不能被AT1和AT2拮抗剂阻断, 提示Ang-(1-7)可能通过非AT1R、 非AT2R发挥抑制VSMCs生长的作用。本研究显示, AngⅡ浓度依赖性地增加VSMCs ~3H-TdR 和~3H-Leu掺入, 而Ang-(1-7) 浓度依赖性地抑制基础和Ang Ⅱ刺激的~3H-TdR和~3H-Leu掺入。

已知丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路在VSMCs的增殖中起重要作用。细胞外各种刺激信号通过不同的信息传递通路,共同交汇于PKC, 激活的PKC通过依赖或非依赖ras机制激活MAPK, 由此形成PKC-MAPK级联反应, 已明确的四条MAPK信号转导通路为ERK1/2、 jNK、 P38MAPK和ERK5通路。其中ERK1/2通路是迄今研究较多的一条MAPK信号转导通路, 生长因子可激活ERK1/2,活化的ERK1/2移位入核磷酸化一系列转录因子, 引起细胞增殖、 分化［5,6］。Liao等报道［1］VSMCs表达PKC-α, -β, -δ,-ε和-ζ等亚型, PKC-ζ在Ang Ⅱ对VSMCs ERK1/2的激活中有重要作用。本研究表明, Ang Ⅱ导致VSMCs PKC-ζ和ERK1/2蛋白表达明显增高;而Ang-(1-7)可以显著抑制基础和Ang Ⅱ介导的VSMCs PKC-ζ和ERK1/2 蛋白表达, 推测Ang-(1-7) 抑制VSMCs的增殖可能与抑制PKC-ζ和ERK1/2蛋白表达有关。最近报道［7］,外源性Ang-(1-7)能抑制球囊损伤导致的血管再狭窄。本研究以培养的大鼠主动脉SMCs为模型, 而非阻力血管SMCs, 虽然有报道主动脉与阻力血管SMCs在形态和功能上有许多相似性,如能应用阻力血管SMCs则更能说明问题。总之, 本研究提示增加内源性Ang-(1-7)生成和补充外源性Ang-(1-7)可能对血管增殖性疾病有治疗价值,这也为高血压和冠心病的治疗提供了新思路。

参考文献

［1］Liao DF, Monia B, Dean N et al. Protein kinase C-ζ mediates angiotensin Ⅱ activation of ERK1/2 in vascular smooth muscle cells. J Biol Chem, 1997,272(10):6146~6150.

［２］Tallant EA, Diz DI, Ferrario CM. State of the art lecture. Antiproliferative actions of angiotensin-(1-7) in vascular smooth muscle. Hypertension, 1999, 34(4 pt 2):950~957.

［３］Freeman EJ, Chisolm GM.Angiotensin-(1-7) inhibits vascular smooth cell growth. Hypertension, 1996, 28:104~108.

［４］Zhu ZM (祝之明), Zhu SJ (祝善俊), Hu HX (胡厚祥). Effect of knockout AT1a receptor gene on transplasma membrane calcium influx in aortic smooth muscle cells. national Med J China (中华医学杂志), 1999, 79(9): 661~663.

［５］Takahashi E, Berk BC. MAP kinases and vascular smooth muscle function. Acta physiol Scand, 1998, 164:611~621.

［６］Seewald S, Seul C, Kettenhofen R et al. Role of mitogen-activated protein kinase in the angiotensin Ⅱ-induced synthesis in vascular smooth muscle cells. hypertension, 1998, 31:1151~1156.

［７］William B, Strawn CM, Ferrario EA. Angiotensin-(1-7) reduces smooth muscle growth after vascular injury. Hypertension, 1999, 33(Pt 2):207~211.