摘要：为探讨肺内神经肽在气道损伤修复中的作用，采用blind-well Boyden chamber 测定原代培养的支气管上皮细胞(bronchial epithelial cells, BEC)趋化性，观察血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)对BEC趋化迁移的影响及其机制，并测定经热应激后BEC分泌VIP及表达VIP受体(vasoactive intestinal peptide receptor, VIPR)的变化。结果显示：(1)以胰岛素作为趋化因子所建立的BEC趋化性测定方法稳定，重现性好(r=0.9703, p＜0.01); (2) VIP (0.001～1 μmol/L)均显示剂量依赖性地增强BEC的趋化迁移，其效应可被钙调蛋白阻断剂及蛋白激酶C阻断剂有效地抑制(P＜0.01)；(3)42℃、30 min热应激后BEC分泌VIP (P＜0.01)及表达VIPR明显增加(P＜0.05)。实验表明：肺内神经肽VIP可增强BEC的趋化迁移，其细胞内信号转导途径与钙调蛋白及蛋白激酶C有关。而热应激时VIP及VIPR的高表达进一步提示局部微环境的VIP可能是气道上皮损伤修复网络中的重要分子。气道上皮是呼吸器官对抗有害刺激的第一道防线。上皮受损后的及时修复是维持气道稳态的重要环节。支气管上皮细胞(bronchial epithelial cells, BECs) 损伤脱落是哮喘和慢性支气管炎等呼吸道疾病的起始环节和病理基础,而气道疾病的缓解有赖于上皮完整性的修复与维持。气道上皮的修复包括细胞向损伤部位迁移、铺展和基细胞增殖分化成纤毛上皮细胞等环节。其中细胞迁移是修复过程的首要环节。

肺内神经肽血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)在肺内含量丰富,近年来备受关注[1]。气道上皮细胞上有VIP受体(vasoactive intestinal peptide receptor, VIPR)表达,提示气道上皮细胞是VIP作用的靶细胞。VIP对BECs趋化迁移有何影响, 国内外尚未见报道。本文在建立BECs 趋化性测定方法的基础上, 观察了VIP对BECs的趋化迁移的影晌,并探讨了其可能的机制。同时用放射免疫方法(放免法)检测了BECs分泌VIP, 用放射配基法测定BECs表达VIPR, 以及热应激预处理后的变化。

1材料和方法

1.1 材料动物: 新西兰兔(1.6±0.4 kg), 雌雄不拘。RPMI1640培养基、 胰蛋白酶、 明胶、 胰岛素、 VIP、 H-７ (PKC抑制剂)、 w-７ (钙调蛋白抑制剂)均为 Sigma产品。青/链霉素、 胎牛血清(fetal calf serum, FCS)为国产。抗角质蛋白免疫组化试剂盒(华美公司), vIP放免测定试剂盒(海科锐公司)。趋化性测定仪(blind-well Boyden chamber), 趋化膜 (polycarbonate chemotaxis membrane), 直径13 mm, 厚10 μm, 孔径8 μm, 美国Neclepore产品。

1.2 兔BEC的分离与培养[2] 新西兰兔, 25％氨基甲酸乙酯耳缘静脉麻醉, 股动脉放血处死。无菌结扎支气管端, 喉端注入含0.05%胰蛋白酶的RPMI1640置充盈, 封口结扎。于37℃消化1 h后, 剪开支气管, 2.5% FCS终止反应。用支气管刷刷取BEC, 通过4号针头打散, 悬浮于D-Hanks中,离心洗涤3次, 细胞计数稀释成106 /ml, 用台盼蓝排斥法计数成活率(87.3±2.8)%, Wright染色纤毛上皮细胞占(85.1±2.6)％,抗角质蛋白(anti-cytokeratin)阳性。用含5％ FCS以及青、 链霉素的RPMI1640 配成悬液, 37℃, 5% CO2培养3 d。

1.3 BEC趋化性的测定培养后的BEC用含0.05%胰蛋白酶RPMI1640于37℃消化10 min, 用2.5％ FCS终止反应。收集细胞,通过4号针头打散, RPMI 1640 洗涤3次, 配成1×106／ml细胞悬液。成活率(89.3±4.1)％。将对照液或待测趋化性的VIP置下室, 上室加入BEC悬液200μl, 中隔经0.1％明胶预处理的趋化膜在37℃、 5% CO2、 饱和湿度下培养6 h。取趋化膜甲醇固定, 瑞氏和姬姆萨溶液混合染色,高倍镜下观察穿过微孔到达膜底面的细胞数, 计数10个视野；以每10个高倍视野(×400)的细胞数(cells/10 hpf)表示BEC的趋化强度。每个样本的BEC趋化性强度为该样本3个同时进行的平行实验的均值,每处理组的样本数不少于6。

分别以10、 30、 90、 180 μg/L 胰岛素作为趋化因子置下室, 作为阳性对照测定BEC的趋化性[3], 以检验趋化性测定方法的稳定性；以1、0.1、 0.01、 0.001 μmol/L的VIP置下室, 观察BEC的趋化迁移变化。在制备好的BEC悬液中分别加入100 μmol/L W-７及H-７于37℃、 温育30 min预处理后, 观察该细胞对0.1 μmol/L的VIP的趋化迁移变化。

1.4 BEC的VIP分泌量测定[4]培养后的BEC 经消化洗涤后悬浮成2×106 cells/ml 于37℃空气孵育稳定2 h,分为对照组及热应激预处理组(42℃, 30 min), 于37℃空气培养16 h, 离心, 收集上清液。用VIP放免药盒按操作程序反应,γ计数。根据标准VIP含量与放射性对应关系, 绘制VIP标准曲线, 计算各样品中的VIP含量。

1.5 BEC的VIPR表达的测定细胞分组与处理同1.4, 热应激预处理后37℃空气培养16 h, 加入125I标记的VIP于4℃孵育48 h,离心洗涤后弃上清。细胞部分γ计数, 计算吸附率, 反映BEC表面的VIPR数量。数据均以mean±SD表示。统计学处理采用ｔ检验与方差分析。

2结果

２.１ BEC趋化性测定方法的建立

与RPMI1640对照组比较, 胰岛素为BEC 有效的趋化因子, 可见在一定的浓度范围内, BEC的趋化迁移与胰岛素量效关系明显, ｒ=0.9703,Ｐ＜0.01。

２.２ VIP对BEC趋化迁移的影响

与 RPMI1640 对照组 (4.2±1.3 cells/10 hpf)相比, VIP能明显增强BEC的趋化迁移,分别为9.5±1.1、15.3±2.1、20.3±3.1和26.0±4.4 cells/10 hpf, 表现出量效关系, r=0.9402,P＜0.01。

2.3 W-７ 及H-７对VIP促BEC趋化迁移的影响

与0.1 μmol/L VIP组的BEC趋化性(21.7±3.8 cells/10 hpf)相比, 经W-７和H-７预处理的BEC趋化性明显下降,分别为9.3±1.8 cells/10 hpf 及 11.5±1.6 cells/10 hpf, P＜0.01。

2.4 热应激对BEC分泌VIP和表达VIPR的影响培养的BEC能分泌VIP及表达VIPR, 经热应激预处理后分泌VIP和表达VIPR明显增加。

3讨论

bEC趋化性的强弱是反映气道上皮修复功能的重要指标之一。本实验在参考国外文献的基础上进行了改良, 成功分离原代培养BEC, 选用胰岛素作为趋化因子, 培养6 h, 测定BEC的趋化性。实验显示所建立的BEC趋化性测定方法结果稳定, 重现性好。

气道上皮是肺抵御环境损伤因子的重要门户, 气道局部的多种因子如降钙素基因相关肽、 速激肽、 P物质等神经肽和表皮生长因子均能加强BEC的趋化性,参与气道上皮的修复[3,5]。VIP具有扩张平滑肌、 抑制嗜酸性粒细胞的释放与粘附[6], 减轻炎症细胞反应、 清除淋巴细胞产生的氧自由基的功能, 并能增强BEC的抗氧化能力, 减轻过氧化损伤, 具有抗损伤保护作用[7]。VIP的血浆浓度较低且半衰期短, 因此, VIP对气道上皮作用的有效程度取决于气道局部的VIP浓度和VIPR的表达密度。本实验检测到BEC能释放VIP并表达VIPR,给予热应激处理后VIP分泌量和VIPR密度均明显增加；进一步的结果显示VIP对BEC表现出较强的趋化作用,提示气道上皮在受损伤等应激情况下创面局部增多的VIP与BEC的相应受体结合, 促进气道上皮基底的细胞上移以及创口边缘的BEC铺展与趋化移行,在创口愈合早期发挥重要作用。而气道上皮局部存在的自分泌以及其它的分泌途径,可能共同构成以VIP为信号分子的保护网络。新蛋白合成、完整的微管功能和肌动蛋白的拉长以及适宜的基质等均是BEC趋化迁移的必要条件[8]。为进一步探讨VIP通过何种细胞内信号转导途径调控BEC的趋化迁移,本文采用W-７和H-７分别阻断钙调蛋白和 PKC, 能显著抑制BEC的趋化性, 提示胞内Ca2+- 钙调蛋白及依赖PKC的蛋白磷酸化均是BEC内信号转导的重要环节,与PKC介导肿瘤坏死因子促BEC趋化迁移的报道一致[9]。以上结果显示, 局部微环境中的神经肽VIP与气道上皮的损伤修复的调控有关。

参考文献

[1]Said SI. VIP as a modulator of lung inflammation and airway constriction. Am rev Respir Dis, 1991,143: S22~S24.

[２]Qin XQ (秦晓群), Sun XH (孙秀泓), Zhang CQ (张长青). Technique of enzyme disgestion adding brushing for isolating bronchial epithelial cells. Bull Hunan Med Univ(湖南医科大学学报), 1999, 24: 74~76 (Chinese, English abstract)．

[３]Kim JS, Rabe KF, Magnussen H, Green J, White SR. Migration and proliferation of guinea pig and human airway epithelial cells in response to tachykinins. Am J physiol, 1995,269 (1 Pt 1):L119~126.

[４]Chen FY (陈方元), Lu GJ (陆国钧), Hou L(侯 雷). Measurement of vasoactive intestinal peptide by immunoradiometric assay. Chin J Nucl Med (中华核医学杂志), 1986, 6: 18~20(Chinese, English abstract)．

[５]Kim JS, Mckinnis VS, Nawrocki A, White SR． Stimulation of migration and wound repair of guinea-pig airway epithelial cells in response to epidermal growth factor. Am J Respir Cell Mol Biol, 1998,18: 66~74.

[６]Wu CG (吴昌归), Mao BL (毛宝龄), Sun B (孙 滨). Effects of vasoactive intestinal peptide on degranulation and adhesion of eosinophils. Chin J Appl Physiol(中国应用生理学杂志), 2000, 16 (1): 239~242 (Chinese, English abstract)．

[７]Qin XQ (秦晓群), Sun XH (