摘要：为了研究细胞核三磷酸肌醇受体在心肌肥厚中的作用, 制备了腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚模型、用差速离心和密度梯度离心提纯心肌细胞核, 以［3H］IP3为配基,采用放射受体分析心肌细胞核膜IP3R与其配体的最大结合容量(Bmax)和解离常数(Kd)。大鼠心肌细胞核上存在IP3R、 CaM和PKC激动剂PMA,能显著抑制该受体与IP3的结合(P＜0.05); 核外［Ca2+］也能剂量依赖的抑制细胞核IP3R与IP3的结合。腹主动脉缩窄术后4周, 大鼠心肌显著肥大,伴有明显的血流动力学异常, 其心肌细胞核IP3R的Bmax和Kd与对照组比较分别增加1.217和2.149倍(P＜0.01)。心肌细胞核上存在IP3R, 并受CaM和PMA及核外［Ca2+］所抑制,心肌细胞核IP3R密度上调和亲和力降低可能参与了压力超负荷心肌肥厚的发生过程。80年代以来, 人们已逐步认识到心肌肥厚是心肌细胞和心肌间质细胞对多种刺激(压力负荷、牵张、 神经体液因子、 血管活性肽、 细胞因子、生长因子等)的适应性反应,是细胞内一系列基因异常表达和细胞表型改变的结果。但调节肥厚过程中耦联肥大刺激到心肌细胞核基因表达重排的分子机制至今尚不清楚。游离钙离子(Ca2+)是细胞内重要的第二信使, ca2+也可作为细胞核内的信号参与细胞分裂、 分化、 DNA复制修复、 基因转录、 核蛋白磷酸化和细胞凋亡等核过程的调节, 因此, 核钙稳态的精密调节,将对细胞功能的维持具有至关重要的意义。近来资料表明, 在大鼠肝细胞核上存在Ca2＋摄取和释放系统, 如核被膜上的Ca2+-ATPase［1］、1,3,4,5-四磷酸肌醇受体(inositol 1,3,4,5 triphosphate receptors, IP4Rs)、1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)受体(IP3 receptors, IP3Rs)［2］和ryanodine受体 (ryanodine receptor, RyR),精确地调控核内［Ca2+］变化, 进而影响核的各种功能。最近, 在心肌细胞核上也发现RyR和IP3R,但是其动力学特性和病理生理意义尚不明确。本实验研究了IP3R的动力学特性及其影响因素, 并观察了腹主动脉缩窄心肌肥厚大鼠心肌细胞核膜IP3R的变化,以进一步探讨心肌肥厚发生的机制。

1材料和方法

1.1 材料与试剂雄性Wistar大鼠, 由本校试验动物中心提供, IP3、钙调素(CaM)、 ATPNa2、 dithiothreitol (DTT)、 phenylmethylsulfonyl fluride (PMSF)、 佛波酯(PMA)、 L-alpha-phosphatidyl-L-serine(PS)以及标志酶测定试剂均购自Sigma; D-myo-［3H］IP3 (1.8 TBq/mmol) 购自于Amersham Pharmacia biotech (England); 其余试剂均为国产GR或AR级, 所用各溶液均以超纯水配制。

１.2 腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚模型制备健康雄性Wistar大鼠(150～200 g), 采用Ohkusa等［3］介绍的方法制备腹主动脉缩窄模型。动物术前禁食过夜,自由饮水, 用乙醚麻醉后开腹, 分离腹主动脉, 在右肾动脉上方沿腹主动脉用丝线将0.8 mm的注射针头扎紧后迅速将针头移去, 缝合关腹。假手术组不做丝线接扎,其它处理相同, 大鼠常规饲养4周。

1.3. 血液动力学测定和心肌肥大计算大鼠称体重(BW), 在戊巴比妥钠(35 mg/kg, ip)麻醉下经颈总动脉插管,用RM-6000生理多道仪记录颈总动脉血压、 平均动脉压、 左室发展压(dp/dmax)和左室舒张末压(LVDEP)。所有导管均充以0.3%肝素生理盐水。然后开胸取出心脏,除作常规病理观察外, 均沿室间隔剔除心房和右心室, 称左心重(LVW)。心肌肥大程度以左室重量指数(LVW/BW)表示。

1.4心肌细胞核的提纯［4］ 所有操作在0～4℃下进行。大鼠麻醉后开胸迅速取出心肌, 用50 ml冰冷TKM液(mmol/L: Tris/HCl 50, kCl 25, MgCl2 5; pH 7.5)洗去红细胞, 剪碎后加入5倍体积的等渗匀浆液(mmol/L:含蔗糖 250, EGTA 1.0, DTT1.0, PMSF 1.0, 和leupeptin、 aprotinin、 pepstatin A各1 μg/ml的TKM液)中。用内切式匀浆器低速匀浆2.5 min (30 s×5次), 200目尼龙布过滤, 离心(1*#400 g, 10 min)２次。 弃上清, 将沉淀加入1倍体积的含1.0 mol/L蔗糖-TKM液中,充分混匀加入3倍体积的2.5 mol/L蔗糖-TKM, 混匀后超速离心(120*#000 g, 60 min)。沉淀即为纯化的心肌细胞核。分离的细胞核纯度采用酶学方法鉴定, 其他细胞器标志酶均小于5%(细胞膜: 5-核苷酸酶和Na+、K+-ATPase; 肌浆网:葡萄糖-6-磷酸酶; 线粒体: 琥珀酸脱氢酶)。采用Lowry法行蛋白质定量, 二苯胺法行DNA定量。用分离纯化的心肌细胞核进行下述实验。

1.5［3H］IP3的放射受体分析［2］核用含(mmol/L) Tris/HCl 50、 EDTA 2.0, pH 8.3的低渗液悬浮,进行［3H］-IP3结合反应, 分别加浓度递增的［3H］IP3 (0.2～15 nmol/L), 反应体积100 μl, 加入核蛋白0.1 mg/管,0℃下反应10 min。结合与游离的放射性配体(［3H］IP3)用离心法(12*#000 r/min, 5 min)分离,沉淀洗涤后用滤纸充分吸净离心管的残留液体, 沉淀经洗涤后加50 μl 1.0 mol/L的NaOH溶解, 再转至10 ml水溶性闪烁液中,用液闪仪测定［3H］IP3放射活性。非特异结合通过加10 μmol/L的IP3测定。由Scatchard分析得到Kd、 Bmax值。

1.6 CaM和PMA对IP3R结合的影响蛋白磷酸化根据Netticadan T等介绍的方法略加调整［5］。取制备的细胞核200 μg, 加入下述缓冲液(mmol/L: tris- HCl 50, MgCl2 10, NaF 10, KCl 80, ATP 4.0, pH 7.4), 在含有(1) 1 μmol/L钙调素(calmodulin, caM), 0.5 mmol/L CaCl2, 0.5 mmol/L EGTA (以激活内源性CaMK); (2) 0.5 mmol/L CaCl2, 0.5 mmol/L EGTA, 50 μg/ml PS, 40 μmol/L PMA(以激活内源性PKC)的条件下, 于20℃孵育30 min,之后用冰冷的缓冲液稀释10倍以终止磷酸化反应。 5*#000 r/min离心10 min收集沉淀的蛋白用于IP3R结合实验(方法同上)。［3H］IP3浓度为5.2 nmol/L, 非特异结合通过加入10 μmol/L的IP3来测定。

1.7核外Ca2+浓度与IP3R结合的关系核［3H］IP3结合反应所用［3H］IP3浓度为1.3 nmol/L, 反应条件同1.5,但反应液中含有不同浓度的自由钙(0、 1×10－7、 1×10－6、 1×10－5、 1×10－4和1×10－3 mol/L)。 根据Chris patton软件的多元缓冲对计算方法，确定所需要的EGTA和总［Ca2+］量。均双复管测定。

1.8数据处理实验数据以mean±SD, 两组比较采用Weltch t检验, 多组间比较采用方差分析(one way ANOVA)组间q检验。

2结果

2.1 形态学和血流动力学指标

实验组大鼠与对照组大鼠体重无显著差异(232±4.8 vs 237±0.4 g), HE染色观察到, 腹主动脉缩窄大鼠左室壁显著增厚, 心肌纤维增粗,排列紊乱。腹主动脉缩窄大鼠左室重量指数较对照增加52.6%, 平均颈总动脉压较对照组高43.1%, 颈总动脉收缩压增加44.5％,颈总动脉舒张压增加44.4%, 左室收缩末压增加25.9％, 左室舒张末压减少59.38%, ±dp/dtmax分别下降22.1%和27.3%,Ｐ均＜0.01。

2.2［3H］IP3与核膜上IP3R结合的饱和分析

本实验置核于低渗缓冲液, 进行［3H］IP3R结合实验。结果显示, 腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚组［3H］IP3与核膜结合的最大容量Bmax比对照组增加1.217(891.0±111.0 vs 401.82±121.4 fmol/mg, P＜0.05)。腹主动脉缩窄大鼠组［3H］IP3与核膜上IP3R结合的Kd与对照组相比较增加2.149倍(20.28±1.98 vs 6.44±0.69, P＜0.01)。

2.3CaM和PMA对IP3R结合的调节

caM通过激活CaM激酶使细胞核磷酸化后, 引起核膜IP3R与［3H］IP3的结合量降低55.9% (53.17±11.64 vs 120.58±40.23 fmol/mg, P＜0.05)。PKC激动剂PMA抑制核膜IP3R与IP3的结合(52.43±27.16 vs 120.58±40.23 fmol/mg, p＜0.05), 结合量降低56.5% 。

2.4 核外Ca2+浓度对IP3R结合的影响

随着反应体系中［Ca2+］的浓度增加, 细胞核IP3R与［3H］IP3的结合呈进行性下降, 如在反应液［Ca2+］ 10－3 mol/L浓度下,心肌细胞核IP3R与［3H］IP3的结合量仅为0钙时的15% 。

3讨论

对压力负荷引起心肌肥厚的机制已进行了大量的研究。近年来的研究证明, 胞内Ca2+信号转导途径与心肌肥厚的发生有关。 然而,胞浆Ca2+如何通过影响核Ca2+进一步参与心肌肥大信号的转导尚不清楚。但已有研究表明, Ca2+并非被动地自由进出细胞核,而是通过细胞核上相对独立的Ca2+转运系统进行主动调节［6］。这一系统可能由Ca2+摄取贮存和释放等成分组成,其中IP3R是一类配基(IP3)操纵的Ca2+释放通道。最早发现它存在于内质网和肌浆网,而最新的研究表明细胞核膜上也存在这一受体［7］。IP3R数目和结构的变化可能会影响到细胞内Ca2+信号的幅度和频率,而Ca2+信号频率和幅度的差异是Ca2+特异调控细胞内不同生理过程的内在机制［8］。核膜Ca2+释放受体IP3R是否在心肌肥厚发生中起重要作用值得探讨。本研究发现,在离体大鼠心肌细胞核被膜上存在IP3高亲和位点, 在腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚时, IP3与核膜结合的最大容量(Bmax)和解离常数(Kd)较对照组均明显增加,说明心肌肥厚发生过程中核膜IP3R数量上调, 而受体与IP3的亲合力降低, 这些变化可能通过影响核内Ca2+信号的变化,进而在压力负荷造成心肌细胞蛋白表达迅速增加、核功能发生改变中起重要作用。有研究发现心肌细胞中含有Ⅱ型IP3R［9］,狗心肌肌浆网SR含有低传导性的IP3敏感的Ca2+通道IP3R, 且比RyR少50倍［10］, 心衰时肌浆网IP3R mRNA表达增加2倍, 同时伴有RyR mRNA表达下降30%, 说明肌浆网IP3R参与心衰时胞内Ca2+信号具有代偿作用［11］。本实验则提供了心肌细胞核IP3R参与心肌肥厚病理过程的直接证据。

对于心肌SR Ca2+释放通道, 已进行了深入研究, IP3、 Ca2+和caffeine均能启动心肌、 骨骼肌肌浆网C