摘要：通过传代培养小鼠骨髓内皮细胞, 收集无血清条件培养液(ECM), 并经超滤得到大于10 kD的浓缩液, 分别观察ECM和大于10 kD的浓缩液复合flt3 ligand (FL)及thrombopoietin (TPO)对体外培养HPP-CFC、 CFU-GM的影响。结果表明: ECM或大于10 kD的浓缩液对HPP-CFC、 cFU-GM的生长均有支持作用; FL或/和TPO与ECM或大于10 kD的浓缩液合用能加强对HPP-CFC、 CFU-GM生长的刺激作用; FL加TPO与ECM或大于10 kD的浓缩液合用对HPP-CFC、 CFU-GM生长的刺激作用更加明显; 选择FL和TPO特异性的引物, 用RT-PCR技术未能检测到小鼠骨髓内皮细胞有FL和TPO mRNA的表达。造血微环境中的基质细胞可以通过其产生形成的造血调节因子网络对造血干/祖细胞的增殖和分化进行调节［1］, 骨髓内皮细胞是骨髓基质细胞的组成成分之一。本室的前期研究表明［2,3］, 小鼠骨髓内皮细胞能产生多种造血调节因子, 其中既有造血刺激因子, 也有造血抑制因子, 在无血清条件培养液(ECM)以及经超滤分离的大于10 kD组分中以造血刺激因子为主, 对高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFC)和粒巨噬系祖细胞(CFU-GM)的增殖有刺激作用。目前已有研究表明: flt3 ligand (FL)和thrombopoietin (TPO)对不同发育阶段的造血干、祖细胞均有明显的刺激作用［4～6］。本研究将观察小鼠骨髓内皮细胞条件培养液复合FL及TPO是否对HPP-CFC及CFU-GM的增殖有更强的刺激作用。

实验用的DMEM培养基为Sigma公司产品。新生小牛血清(NBS)购自杭州四季清生物工程材料研究所。马血清购自中国军事医学科学院。rmGM-CSF、rmFL、rmTpo均为Genzyme产品。RNA酶抑制剂(RNasin)、 aMV逆转录酶(AMV-RTase)、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 Oligo(dT)15等购自Promega公司。小鼠FL引物为: P1: 5′ACA~CCT~GAC~TG~TTA3′, P2: 5′AT~CT~TTA~AGC~AGG~TG~GTC 3′; 小鼠TPO引物为: P1: 5′TCT~GTCCA~GCCCCG~TAGG~TC3′, P2: 5′GTT~CCAT~CCA~CAGGT CCGTG 3′; β-Actin引物为: P1: 5′ACC~AAC~TGGG~ACGA~CATG~GAG~AAA~ATC3′, P2: 5′GTA~GCCG~CGC~TCG~GTGA~GGAT~CT~TCAT 3′, 均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

小鼠骨髓内皮细胞系传代培养及ECM的制备小鼠骨髓内皮细胞系细胞培养于含20％ NBS的DMEM培养液中, 置于37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下进行传代培养,每周2次半量换液。当接种的细胞生长至形成亚融合层时, 去除上悬液, 用磷酸缓冲液(PBS, pH 7.2)洗3次, 洗净细胞及培养瓶上的残留血清。然后加入DMEM培养48 h, 吸取上悬液, 离心, 收集上清, 经0.45 μm孔径微孔滤膜过滤除菌, 一部分ECM分装后于－20℃保存。另一部分ECM用分子量截留值为10 kD的离心超滤器连续超滤,以去除分子量小于10 kD的成分并使大于10 kD的成分浓缩5倍, 小于10 kD的物质稀释近500倍, 大于10 kD ECM浓缩液经分装后于－20℃保存。

骨髓造血干/祖细胞培养CFU-GM及HPP-CFC培养均采用琼脂半固体培养法。CFU-GM培养体系为: DMEM培养液, 30％马血清, 0.3％琼脂,骨髓单个核细胞浓度为2×105/ml, 1.5％大于10 kD ECM浓缩液或12％ECM原液; 每培养体系0.5 ml, 每组种3孔, 用24孔板培养,置于33℃、5％CO2、饱和湿度下培养7d。 倒置显微镜下以≥50个细胞计数为一个集落, 细胞形态学检查, 集落由粒细胞和单核细胞组成, 计数CFU-GM集落数。HPP-CFC培养体系为: dMEM培养液, 30％马血清, 0.3％琼脂, 骨髓单个核细胞浓度2×105/ml, GM-CSF 50U/ml, 1.5％大于10 kD ECM浓缩液或12％ECM原液; 每培养体系0.5 ml, 每组种3孔, 用24孔板培养, 置33℃、5％CO2、饱和湿度下培养14d。在倒置显微镜下观察到HPP-CFC集落直径大于1.0mm,细胞数大于50*#000个, 集落松散均匀, 但有一个致密的集落中心。 经细胞形态学检查, 集落由粒细胞和单核细胞组成, 计数HPP-CFC集落数。实验组加入FL100 ng/ml 或/和TPO 50 ng/ml, 对照组加入等体积DMEM。

rT-PCR检测FL和TPO在骨髓内皮细胞中的表达常规方法提取待测细胞的总RNA并进行RT反应, PCR反应条件为: 94℃ 1 min, 55℃ 50 s,72℃ 1 min, 进行35个循环; PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察结果, FL引物扩增片段为87 bp, TPO引物扩增片段为717bp,β-Actin引物扩增片段为371 bp。

统计学分析实验数据以mean±SD表示, Sigmaplot软件作图, 各组间比较采用方差分析, 两两比较采用q检验。

实验结果如下:

1. 大于10 kD ECM 浓缩液或ECM原液促进CFU-GM及HPP-CFC生长的剂量反应关系

大于10 kD ECM 浓缩液或ECM原液在体外能支持CFU-GM的生长, 取不同浓度的大于10 kD ECM 浓缩液(0.5%～2.5％)或ECM原液(4%～20％)作量效关系测定。大于10 kD ECM浓缩液在 0.5％～1.5％范围内, CFU-GM 产率逐渐增加, 2％浓度点不再增加, 2.5％浓度点产率降低; ECM原液在4％～12％范围内, CFU-GM产率逐渐增加, 16％浓度点不再增加, 20％浓度点产率降低。大于10 kD ECM 浓缩液或ECM原液在GM-CSF存在的条件下支持HPP-CFC的生长,取不同浓度的大于10 kD ECM 浓缩液(0.5%～2.5％)或ECM原液(4%～20％)作量效关系测定, 大于10 kD ECM浓缩液在0.5%～1.5％范围内, hPP-CFC产率逐渐增加, 2％浓度点不再增加, 2.5％浓度点产率降低; ECM原液在4%～12％范围内, HPP-CFC产率逐渐增加,16％浓度点不再增加, 20％浓度点产率降低。

2. 大于10 kD ECM 浓缩液或ECM原液复合FL 或/和TPO对CFU-GM产率的影响

大于10 kD ECM浓缩液或ECM原液均能支持CFU-GM的生长且在一定范围内呈剂量依赖性增强作用, 1.5％大于10 kD ECM 浓缩液或12％ECM原液即可达到最佳的支持CFU-GM生长的效果。将1.5％大于10 kD ECM 浓缩液或12％ ECM原液组作为对照组, 与对照组相比, 加入FL100 ng/ml 或/和TPO 50 ng/ml, 均能显著增加CFU-GM的产率,其中, FL联合大于10 kD ECM浓缩液或ECM原液, 其CFU-GM的产率分别为对照组的124.85％±6.88%和120.35％±5.50%; TPO联合大于10 kD ECM浓缩液或ECM原液, 其CFU-GM的产率分别为对照组的134.13％±6.19%和130.03％±4.94%; FL和TPO联合大于10 kD eCM浓缩液或ECM原液, 其CFU-GM的产率分别为对照组的174.11％±6.73%和164.19％±5.57%。

3. 大于10 kD ECM或ECM原液复合FL 或/和TPO对HPP-CFC产率的影响

1.5％大于10 kD ECM或12％ ECM原液在GM-CSF 50 U/ml存在的条件下均能支持HPP-CFC的生长, 将GM-CSF 50 u/ml加1.5％大于10 kD ECM或12％ECM原液组作为对照组, 与对照组相比, 再加入FL 100 ng/ml或/和TPO 50 ng/ml,均能显著增加HPP-CFC的产率(图3)。 其中FL联合大于10 kD ECM浓缩液或ECM原液, 其HPP-CFC的产率为对照组的136.89％±11.62%和136.79％±11.97%; tPO联合大于10 kD ECM浓缩液或ECM原液, 其HPP-CFC的产率为对照组的156.31％±13.31%和154.72％±13.49%; FL和TPO联合大于10 kD ECM浓缩液或ECM原液, 其HPP-CFC的产率为对照组的。

4. FL和TPO联合大于10 kD ECM或ECM原液对CFU-GM及HPP-CFC产率影响的比较

fL和TPO联合大于10 kD ECM浓缩液或ECM原液, 其CFU-GM的产率分别为对照组的174.11％±6.73%和164.19％±5.57%; FL和TPO联合大于10 kD ECM浓缩液或ECM原液, 其HPP-CFC的产率为对照组的200.97％±24.24%和200.94％±18.89%。FL和TPO联合ECM或大于10 kD的浓缩液, 对HPP-CFC的促生长作用明显大于CFU-GM。

5. 小鼠骨髓内皮细胞中FL和TPO mRNA表达的检测

如图5所示, 小鼠内皮细胞的泳道只有内标β-Actin的扩增片段, 而未见FL和TPO的特异性扩增片段出现。

本实验将外周血单个核细胞和骨髓基质细胞分别作为表达FL和TPO基因的阳性对照, 设立的阳性对照的泳道既有内标的扩增片段，也可见到FL或TPO的特异性扩增片段。

造血干/祖细胞的增殖、分化有赖于造血调节因子的调控。为了实现造血干/祖细胞的体外扩增, 研究者一直在尝试建立有效的体外扩增体系。早期,人们在培养体系中加入各种造血刺激因子, 结果在血细胞扩增的同时, 造血干细胞分化; 鉴于体内造血微环境既能生成大量血细胞, 又能有效实现造血干细胞的自我复制,因此近年来关于如何在体外模拟体内造血微环境, 以实现造血干/祖细胞长期有效的扩增已成为这一领域研究的热点。

在造血微环境中的基质细胞所分泌产生的造血调节因子, 是微环境中造血调节因子的主要来源。因此, 围绕基质细胞在支持造血中的作用进行了大量的研究,骨髓内皮细胞作为骨髓基质细胞中的一种重要的细胞成分, 其在造血中的作用已日益受到关注。首先是关于非骨髓来源的血管内皮细胞在体外支持造血的报道［7］, 继而又有Raffi和Almeidda porada等报道, 人的骨髓内皮细胞能表达多种造血调节因子［8,9］。人们在进行基质细胞层或基质细胞条件培养液支持造血研究的同时,也开始尝试在前两者的基础上加上各种造血刺激因子, 以期得到更好的扩增效果。

本室的前期工作提示: ECM小于10 kD组分含有小分子抑制物, 业已证实小于10 kD组分中有Thymosin-β4、AcSDKP和MIP-2α等小分子物质,在大于10 kD组分和ECM原液中以造血刺激因子为主［3,10,11］。本实验亦表明: 大于10 kD组分和ECM原液均对HPP-CFC、CFU-GM的生长有支持和促进作用;大于10 kD组分由于去除了小分子抑制物, 其有效刺激浓度为1.5%,而ECM的有效刺激浓度为12%, 两者相比大于10 kD组分的有效刺激浓度明显低于ECM。但大于10 kD的ECM和ECM浓度超过一定范围, 反而对CFU-GM和HPP-CFC的生长起抑制作用, 这可能是由<