摘要：神经营养素3(neurotrophin 3, NT3)作为螺旋神经节细胞特异的营养因子, 可有效地支持内耳传入神经元的存活,因此有望成为治疗因其退变而引起的感音性神经性耳聋的有效因子。实验采用腺病毒介导lacZ基因, 检测了外源基因在豚鼠内耳中的长期表达。用噪音制备了豚鼠耳聋模型,在噪音损伤后第7天, 通过圆窗膜注入1×108重组腺病毒。注入神经营养素3重组腺（Ad-NT3）的组为实验组, 注入Ad-lacZ的为对照组。4周后,经NT3抗体免疫细胞化学染色可见, 在注入Ad-NT3病毒的实验组中, 在内耳多种细胞中有明显的NT3蛋白的表达。HE染色显示, 注射Ad-lacZ组的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞明显退变,螺旋神经节内细胞间隙拉大, 细胞密度明显低于注射Ad-NT3实验组动物（P＜0.01）。这一结果说明, 腺病毒介导的NT3基因可长期表达于内耳中,并且可在噪音引起毛细胞死亡后有效地抑制螺旋神经节细胞的退变。耳蜗螺旋神经节细胞作为听觉传入的初级神经元, 维持一定数量健康、 正常的神经元对于听力功能的维持是十分必要的。病理学研究显示, 噪音、耳毒素和感染等多种损伤均可不同程度地引起毛细胞和螺旋神经节细胞的损伤, 在Corti氏器中的毛细胞可提供多种营养因子以维持螺旋神经节细胞的存活,因此毛细胞的死亡往往进一步引起螺旋神经节细胞的退变和死亡［1］。作为神经营养因子家族成员的神经营养素3(neurotrophin 3, nT3)在内耳神经元的发育和正常生理功能的维持中起着重要的作用［2］。由于NT3作为蛋白质类物质不易通过血脑屏障, 且半衰期短,为了有效地将NT3导入靶区并在靶区长期稳定表达, 以达到对耳蜗传入神经元损伤的治疗目的, 我们利用腺病毒介导的NT3基因在噪音引起的豚鼠耳聋模型上进行了研究。

1材料和方法

1．1 病毒 Ad-NT3为本实验室构建［3］, 纯化、 浓缩后的病毒液体保存在-80℃。实验选用的腺病毒载体为E1区缺失(1.0~9.8 μm)的病毒(购自加拿大Microbix biosystems公司)。

1．2 豚鼠噪音耳聋模型的制备 选用健康成年白色纯种豚鼠 (250~300 g, 耳廓反射正常), 暴露于135 dBSPL、 1/3倍频程、 4 kHz的窄带噪声4 h, 在噪声前后分别行ABR检测, 其听阈阈移大于75 dBSPL者作为实验动物［4］。实验动物随机分成两组:NT3组和lacZ组。

1．3 动物手术过程及取材 将复方氯胺酮注射液(军事医学科学院毒物药物研究所)1∶5稀释后, 按照每100 g体重肌肉注射80 μl麻醉豚鼠。从耳后剪开皮肤和肌肉组织,暴露出听泡, 在其上打一小孔可见耳蜗底转(basal turn), 用5 μl微量注射器从圆窗下插入外淋巴液中, 缓慢注入病毒注射液, 每耳注入5 μl共１×108个病毒,分别于手术后3天、 1周、 1个月断头杀鼠, 取听泡, 打开、 暴露耳蜗, 从蜗尖处打一小孔, 用4%多聚甲醛灌流固定,继续浸泡于4%多聚甲醛中置于4℃固定过夜。

1．4 X-Gal染色 固定过夜的耳蜗组织经PBS洗后, 置于X-gal染液中于37℃染色过夜。以10% EDTA脱钙10 d后, 石蜡切片(7 μm厚),光镜下观察蓝染细胞。

1．5 NT3免疫组化染色 耳蜗组织经过固定、 脱钙后, 用石蜡包埋、 切片, 经二甲苯脱蜡, 梯度乙醇复水, 用0.01 mol/L PBS/0.3% triton X-100/10% 正常羊血清封闭2 h, 将NT3抗体1∶500稀释于1% 羊血清/PBST (0.01 MPBS+0.05% Triton x-100)中孵育过夜。 将二抗羊抗兔IgG 1∶1000稀释于PBST中, 室温3 h, AB复合物1∶1000稀释于PBST中, 室温2 h,用DAB硫酸镍铵加强法显色。

1．6 HE染色及光镜下螺旋神经节细胞计数 将固定的切片经苏木精液染色数分钟后, 用稀盐酸乙醇溶液分色, 然后浸入1% 伊红染液染5~10 min,再经70%乙醇分色, 系列乙醇脱水, 直至胞质与胞核的红蓝反差鲜明。按文献［5］所述方法, 目镜加网格片, 每小格在40×10放大倍数下覆盖面积为10×10μm, 计算螺旋神经节细胞数(只计数一二回数目)。

2结果

2．1 Ad-lacZ感染正常豚鼠耳蜗X-Gal的染色结果

首先, 我们利用Ad-lacZ病毒建立了豚鼠内耳给药途径。 正常豚鼠在注入１×108个Ad-lacZ病毒后1个月, 杀鼠取耳蜗组织。在X-Gal染色切片后,可清楚看到在基底膜鼓阶面上皮细胞、 螺旋唇缘上皮细胞、 Corti氏器以及螺旋神经节细胞均被染成蓝色。虽然我们是从耳蜗的底转注入重组病毒的,但由于内、外淋巴液的循环, X-Gal染色显示整个耳蜗均可被病毒感染。 lacZ报告基因可在多种细胞中表达, 包括螺旋韧带、 血管纹、 支持细胞、毛细胞以及螺旋神经节细胞本身。这说明通过这一方法可有效地将外源基因引入耳蜗的螺旋神经节细胞及靶区的毛细胞和支持细胞。本实验中使用的是5 μl的微量注射器,单点将病毒缓慢注入, 耳蜗纵向切片的结果显示这一方法对耳蜗结构的破坏很小。

2．2 Ad-NT3在豚鼠耳聋模型上的表达

在噪音损伤时, 有时某些动物的听阈可发生暂时性的阈移, 3、 4 d后又可恢复正常。为了避免听力暂时性阈移情况的出现, 我们在噪音损伤1周后, 以ABR测听,选择听阈阈移＞75 dB SPL的豚鼠为耳聋模型。实验组注入Ad-NT3病毒, 对照组注入Ad-lacZ病毒。1个月后, 对实验动物耳蜗组织进行切片, nT3抗体染色, 可见耳蜗各回中均有NT3基因表达, 且在注射病毒后直至1个月,在耳蜗纵轴切片上的螺旋唇沿和螺旋上皮等处均可看到阳性细胞的存在。同时在此切片上, 可观察到经过爆震后听神经的靶器官Corti氏器被损毁。

2．3 HE染色观察螺旋神经节的形态变化

分别取注入Ad-NT3实验组和对照组Ad-lacZ的耳蜗纵轴切片进行HE染色, 观察螺旋神经节细胞的形态和数量。注射Ad-lacZ组的豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞明显退变,神经节细胞间隙拉大, 细胞死亡数量明显增多。而注射Ad-NT3的实验组中螺旋神经节细胞的数目明显多于对照组细胞, 细胞的状态也与正常动物相近,细胞核致密且染色深。这一结果说明腺病毒介导的NT3基因可长期表达于内耳中, 并且可在噪音引起毛细胞死亡后有效地抑制听神经元的退变。

3讨论

在内耳的发育过程中, 需要多种营养因子共同发挥作用, 其中神经营养因子家族成员起着重要的作用。内耳中有螺旋神经节和前庭神经节两个神经节,分别起着维持听力和平衡的作用。 NT3基因作为神经营养因子家族成员中的一员, 对耳蜗螺旋神经节细胞有着特异性的营养作用［6］。原位杂交实验显示,在胚胎发育过程中NT3 mRNA表达在内耳的感觉上皮中, 其受体TrkC表达在耳蜗螺旋神经节细胞上［7］,在成年大鼠的内毛细胞中也可检测到NT3基因。基因敲除实验进一步证实, 在NT3和trkC基因敲除的小鼠中， 大约80%的螺旋神经节细胞缺失,而前庭神经节细胞数量不受影响［8］。在体外培养的螺旋神经节细胞实验中, NT3可有效地促进神经元的存活［9］。由于多种因素如噪音、 毒物、病毒感染等均可引起毛细胞和螺旋神经节细胞的损伤, 而毛细胞的死亡又可进一步地引起螺旋神经节细胞退变。在患有疾病的耳蜗中,螺旋神经节细胞的存活数目往往反映疾病的病理生理改变,因而维持一定数量的健康的螺旋神经节细胞对于疾病的治疗(如耳蜗移植)及治疗后听力的提高十分重要。作为螺旋神经节细胞的营养因子NT3对于听神经损伤的治疗是很有希望的因子。

基因治疗目前已在人类的数种疾病上进行了临床实验, 如腺苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)缺乏症、 家族性的高胆固醇血症、囊性纤维化和肿瘤等。耳蜗组织作为基因转移的靶器官有以下的一些优点。首先, 在解剖结构上耳蜗是一个骨性的腔, 这提供了一个于周围组织相对分离的空间。另外,在耳蜗中的液体成分充满了耳蜗的底部到顶部, 可以通过这一液体使病毒载体在整个耳蜗中扩散。在实验中, 我们将lacZ重组腺病毒从耳蜗的底部圆窗注入,经X-Gal染色后, 在耳蜗纵轴切片上从蜗底到蜗尖均有蓝染细胞,通过这一方法可有效地将外源基因转入耳蜗中。由于对螺旋神经节细胞退变引起的神经性耳聋目前一直没有很好的治疗方法,因此利用基因治疗的途径是值得尝试的方法。在本实验中我们利用腺病毒介导的NT3基因转染耳蜗可长期有效地将NT3基因表达于耳蜗组织中,并可阻止噪声引起的螺旋神经节细胞退变, 这对于螺旋神经节细胞损伤的治疗是十分有效的。选择合适的载体系统是基因治疗的关键之一, 腺病毒由于其高感染性、 低病原性,以及可感染非分裂细胞, 因而在目前神经系统的基因治疗中被认为是合适的载体［10］。尽管腺病毒在神经系统的基因治疗中具有许多优越性, 但也存在着一些缺点和问题,如腺病毒注入体内可引起免疫和炎症反应。为了解决这一问题， 人们对腺病毒载体进行了改构以降低和清除腺病毒蛋白在感染后的微弱表达,目前已经成功地构建了在体内可稳定表达10个月以上、并没有免疫反应发生的新型腺病毒载体［11］。对腺病毒载体改构工作的不断完善,为其最终用于神经性耳聋临床治疗打下了坚实的基础。

参考文献

［1］Miller JM, Chi DH, O′keeffe LJ, Kruszka P, Raphael Y, Altschuler RA. neurotrophins can enhance spiral ganglion cell survival after inner hair cell loss. Int J Dev Neurosci, 1997, 15:631~643.

［2］Ernfors P, Van De Water TR, Loring J, Jaenisch R. Complementary roles of BDNF and NT3 in vestibular and auditory development. Neuron, 1995, 14:1153~1164.

［3］Chen Q(陈 谦), Wang JZ(汪家政), Liu H(刘 红), Wu Y(吴 燕), Fan M(范 明). Construction and characterization of recombinant adenoviruses expressing biologically active human brain-