摘要：为探讨ClC-1通道的门控机制, 实验应用爪蟾卵母细胞异源性表达大鼠野生型ClC-1(WT rClC-1)通道基因,并使用双电极电压钳法记录通道电流。通过改变细胞外氯离子浓度, 采用双指数拟合的方法分析通道去激活电流, 对其去激活门控动力学特性进行了研究。结果表明,降低细胞外氯离子浓度可增加快速去激活电流成分, 减少慢速去激活成分; 同时, 慢速去激活和快速去激活电流的时间常数都显著减小,说明细胞外氯离子浓度的改变可影响通道去激活动力学参数, 从而改变通道的门控过程。氯离子通道在细胞兴奋性调节、 跨上皮物质转运、 细胞容积调节、 细胞器酸化作用中发挥重要的作用, 甚至在细胞免疫应答、 细胞迁移、细胞增殖和分化等过程中也有一定作用［1］。ClC通道是一类电压门控的氯离子通道。目前在哺乳动物细胞中已经克隆得到了九种不同的ClC通道, 而且在植物、 酵母、细菌中也发现了这种通道蛋白［2］。ClC-1是第一个在哺乳动物中克隆得到的ClC 通道, 主要在骨骼肌表达［3］。 clC-1通道电导减小或缺失可导致肌强直疾病。ClC-1通道电流的特点是去极化快速激活, 无失活, 超极化去激活, 单通道电导约1 pS［4］。但由于激活的速度很快、 单通道电导小, 很难通过去极化电流和单通道电流分析其门控特性, 对其门控特性的研究主要借助于其去激活电流。3期 张晓东等:细胞外氯离子浓度对大鼠ClC-1通道去激活动力学特性的影响 生理学报Acta Physiol. Sin. 54卷ClC-1通道的门控特性一直是研究的重点, fahlke等［5］认为, ClC-1通道存在类似阳离子通道的电压感受器结构, 电压感受器是某些带电荷的氨基酸残基。Rychkov等［6］认为,氯离子和其他阴离子与通道某些位点的结合可控制通道的开放, 离子通透和门控过程紧密相关。因此,对于ClC-1门控机制目前尚存在争议［2］。本文应用在爪蟾卵母细胞上异源性表达大鼠野生型ClC-1(WT rClC-1)基因,研究细胞外氯离子浓度改变对该通道去激活门控动力学特性的影响。

1材料和方法

1.1 细胞的准备和培养采用非洲爪蟾卵母细胞表达WT rClC-1基因。雌性爪蟾(由北京发育生物研究所提供)室温饲养在玻璃水槽中, 水深约15～25 cm,每周需要更换饲养水两次。卵母细胞的制备和培养方法见文献［7］。简单来说, 就是手术取出爪蟾的卵母细胞,采用胶原酶消化分离成单个细胞。若细胞上的滤泡膜未完全脱落, 可在显微镜下用5号钟表镊小心剥离。然后, 置于18℃的ND96液体［8］(mmol/L: NaCl96, KCl 2, CaCl2 1.8, MgCl2 1, HEPES 5, 用NaOH 调节pH至7.5, 高压高温灭菌)中培养。

1.2 mRNA的体外转录和注射WT rClC-1 基因由德国Hamburg大学分子神经生物中心的Jentsch博士提供, 被连接在pTLN质粒载体中。取质粒DNA 3~5 μg, 应用Mlu I 内切酶线性化切割, 37℃ 加热1 h 。加1 μl 蛋白酶K (1 mg/ml), 37℃加热0.5 h。应用GeneClean 试剂盒对线性化的DNA进行提纯(Bio 101, USA)。使用提纯后的DNA约1~2 μg进行体外转录。转录采用体外转录试剂盒(Ambion, USA) 所提供的试剂和步骤进行。一次转录约可获得20 μl约15~20 μg mRNA, 取1 μl用分光光度计(Beckman, uSA)测量其浓度, 并用无核糖核酸酶的去离子水稀释到需要的浓度。本实验最后稀释的浓度约0.2 ng/nl。在转录过程中要注意避免核糖核酸酶的污染。

注射mRNA采用纳升注射器(Drummond Nanojector II, Drummond Scientific, uSA)和其专用的玻璃电极。使用电极拉制器P-97(Sutter Instrument, USA)拉制电极。经尖端打磨、 甲醇清洗, 置于230℃高温灭菌30 min待用。注射时, 先在电极中充入硅油密封隔离, 每个卵母细胞注射50 nl mRNA, 对照组注射等体积的去离子水。注射后,卵母细胞被放回18℃孵箱培养24~48 h, 每日需要更换培养液。

1.3 双电极电压钳记录通道电流在注射mRNA 2~5 d内对其表达的通道电流进行记录。电流记录使用双电极电压钳法, 放大器为Dagan CA-1(Dagan corp, USA), 数据采集采用pClamp6.0.4(Axon Instruments, USA)。采用接地的金属板,置于电流注入电极和电压监测电极之间，减少电容耦合干扰。使用P-97拉制硼硅玻璃微电极, 电流注入电极电阻: 0.5~1 MΩ, 电压监测电极电阻: 0.5~2 mΩ。记录时, 采样频率为10 kHz, 放大器输出滤波频率为2 kHz。电极内液采用3 mol/L KCl溶液, 标准细胞外液为ND96溶液［3,9］。改变细胞外氯离子浓度时, 采用2 mol/L KCl 盐桥, 减小电极电位的偏移。氯离子浓度改变可通过改变ND96液体中的NaCl浓度, 但需要使用D-Manitol调节液体的渗透压使其与ND96相同,渗透压测量使用渗透压计OM802 (Vogel, Germany)。实验在室温22℃下进行, 灌流速度约为2~3 ml/min。

1.4 数据分析方法通道去激活电流曲线采用双指数函数I(t)=A0+A1e－(t －t0)/τ1+A2e－(t－t0)/τ2拟合进行通道的动力学分析［5］。式中A0, A1, A2分别表示非去激活电流成分、 快速去激活电流成分和慢速去激活电流成分的幅度, t代表时间, t0为拟合的起始时间, τ1和τ2代表时间常数, 各电流成分所占的比率可用A0, A1, a2对最大电流的归一化表示。可通过拟合函数外推计算的方法得到峰值电流。根据尾电流对稳态时通道的相对开放率, 对电压的依赖性变化进行定量分析［9］。记录电流时,先施加40～－140 mV的不同钳制电压100 ms, 随后应用一个－100 mV, 20 ms的电压脉冲,根据瞬间峰值尾电流的相对大小计算不同钳制电压下通道稳态的相对开放率。数据分析采用Origin6.0。实验结果为5个不同卵母细胞上记录的电流对各自最大瞬间电流的归一化平均值。结果采用Mean±SD表示。

2结果

改变细胞外氯离子浓度时, 在持续灌流下分别记录通道电流的改变。 可见通道电流随细胞外氯离子浓度的降低而减小。 A、 B、 C、 D、 e分别是细胞外氯离子浓度为103.5、 80、 50、 20和10 mmol/L时记录到的通道电流; F是注射去离子水的卵母细胞上的电流记录结果; g为使用的钳制电压波形。

采用通道动力学分析的方法, 对WT rClC-1在－120 mV钳制电压下记录的去激活电流用双指数函数进行拟合。可见去激活电流由三个成分组成,即快速去激活电流、慢速去激活电流和非去激活电流。

使用ND96灌流时快速去激活电流对应的时间常数为3.02±0.46 ms, 慢速去激活电流对应的时间常数为29.10±2.06 ms。随着细胞外氯离子浓度的降低, 非去激活的稳态电流成分先减小后有所增加, 快速去激活电流成分增加,慢速去激活的电流先减小后有所增加。快速去激活电流和慢速去激活电流对应的时间常数都减小, 特别是慢速去激活电流对应的时间常数τ2由29.110±2.06 ms减小到2.44±0.41 ms。当细胞外氯离子浓度减小到10 mmol/L时, τ1=0.75±0.28 ms, τ2=2.44±0.41 ms。

记录经不同电压钳制达到稳态后的瞬间尾电流, 对稳态时通道的相对开放率对电压和氯离子浓度的依赖性进行定量分析。在－120 mV钳制电压下,稳态时通道的相对开放率(Po)对细胞外氯离子浓度的依赖性曲线。随着氯离子浓度的降低, 稳态时通道的相对开放率逐渐减小, 而且在－140±40 mV整个钳制电压范围内都有类似的结果。

3讨论

clC-1通道电流的特点是去极化激活, 超极化去激活。去激活的速度与超极化电压有关, 而且去激活最终会得到一个稳态的内向电流。去极化激活的速度很快, 且无失活,而超极化的去激活表现为瞬间电流增加并很快衰减到一个稳态电流。因此,一般采用去激活电流对ClC-1通道的门控特性进行分析［2］。本文采用双指数函数拟合的方法得到了电流的三个成分,它们对应三种不同的门控状态。幅度成分反映了各状态所占的比例, 而时间常数反映了各状态通道开放和关闭的切换速度。

rychkov等［10］(1996)发现大鼠ClC-1通道电流受细胞外氯离子浓度改变的影响, 分析了去激活动力学参数对电压的依赖性变化,提出细胞外氯离子浓度可影响通道的门控过程, 但没有深入分析细胞外氯离子浓度改变对去激活动力学参数的影响。Fahlke等［5］认为, clC-1通道存在电压感受器, 细胞外阴离子可与通道上的某些点结合, 结合程度决定该阴离子的通透性, 而细胞外阴离子对门控过程无直接影响。本文的实验结果表明,细胞外氯离子浓度的变化对ClC-1通道的门控过程具有明显的调节作用。随着细胞外氯离子浓度的降低, 慢速去激活电流的时间常数迅速减小;快速去激活电流幅度所占的比例增加,慢速去激活电流和非去激活电流成分先减少后有所增加。这说明细胞外氯离子浓度的降低有利于通道的门控状态向快速去激活门控状态的改变。而且,随着细胞外氯离子浓度的降低, 通道稳态的相对开放率也减小。

氯离子浓度的改变如何影响ClC-1通道的去激活动力学特性？一种很可能的方式是氯离子作为配体与通道外或通道内一些带正电荷的位点结合或分离, 引起通道蛋白构象变化,导致通道的去激活特性改变。这种通道调节方式可很好地解释ClC-1氯离子通道的电压依赖性, 门控特性以及在超极化电压下通道的去激活特性。但仍需要进一步的研究工作,才可能揭示ClC-1通道的门控和离子通透之间的关系。***感谢德国Hamburg大学的分子神经生物中心T.J.Jentsch博士提供的WT rClC-1 质粒,感谢日本国立生理学研究所细胞生理实验室Y.Okada教授、 S.Morishima和R.Z. Sabirov博士的帮助与有益的讨论。

参考文献

［1］Jentsch TJ， Günther W. Chloride channels: an emerging molecular picture. bioessays, 1997,19:117~126.

［２］Jentsch TJ, Friedrich T, Schriever A. The ClC chloride channel family. Eur J physiol, 1999,437:783~795.