摘要：通过观察下述五个指标, 评价肾上腺髓质素(adrenomedullin, Adm)对大鼠损伤性心肌肌浆网功能的改善程度: 左心室压力最大变化速率(±dp/dtmax)、肌浆网钙摄取和释放及钙泵活性。皮下注射异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO, 69 μmol/kg体重)制备大鼠心肌损伤坏死模型。摘取心脏后用Adm灌流, 观察左心室压力最大变化速率(±dp/dtmax); 制备并提纯心肌肌浆网(sarcoplasmic reticulum, SR)膜, 测定SR ca2+摄取和释放速率、 SR 钙泵活性和钙通道蛋白 ~3H-ryanodine受体的最大结合量。结果发现, 5×10－５ mol/L Adm灌流能使ISO损伤的大鼠心脏左室±dp/dtmax分别增加16.9%(2?135±281 vs 1?980±302)和29.2% (1?375±267 vs 1?064±355, 均P＜0.05); SR ca2+摄取和释放率分别增加23.0%(15.0±1.4 vs 12.2±1.2)和43.5%(6.6±1.0 vs 4.6±0.6, 均P＜0.01); sR Ca2+-ATPase活性和 ~3H-ryanodine受体最大结合量(Bmax)分别增加24.2% (P＜0.01) 和42.2%(P＜0.05)。提示Adm对ISO诱导的大鼠心肌损伤具有保护作用,其机制可能与Adm增加SR Ca2+-ATPase活性、 增加 ~3H-ryanodine所致SR Ca2+ 摄取和释放升高有关。外源性给予Adm对损伤心肌可能具有临床治疗作用。肾上腺髓质素(adrenomedullin, Adm)是Kitamura等［1］于1993年从人的嗜铬细胞瘤细胞中分离出的一种新的心血管活性多肽, 人Adm由52个氨基酸组成,具有利钠利尿和扩血管等多种生物学效应。急性心肌梗死患者血浆中Adm浓度升高, 与心功能呈负相关［2］。推测Adm浓度升高可能是对急性心肌梗死的代偿性保护。我们实验室曾报道Adm对异丙肾上腺素(isoproterenol,ISO)诱导的大鼠心肌损伤具有保护作用［3］,但Adm心肌保护的细胞机制目前尚未完全阐明。本工作在ISO诱导的大鼠心肌损伤坏死模型上观察Adm对心肌肌浆网钙摄取和释放、 肌浆网钙通道蛋白ryanodine受体和钙泵的影响,以探讨Adm对ISO心肌损伤保护作用的细胞分子机制。

1材料和方法

1.1 ISO心肌损伤坏死模型制备用体重200~250g雄性大鼠按Rona方法［4］制作ISO心肌坏死模型。动物随机分为2组, 每组24只。模型组每天按69μmol iSO/kg体重皮下注射1次, 连续3 d; 对照组注射生理盐水, 连续3 d。

1.2 离体心脏灌流与实验分组末次注射药物24 h后注射乌拉坦 (1 g/kg, ip)以麻醉大鼠, 用肝素(1?000 U/只, ip)抗凝。处死动物后迅速摘取心脏置于冷生理盐水中,将其悬挂于Langendorff灌流装置上。 于95% O2-5% CO2平衡的37℃恒温的Krebs-Henseleit (K-H) 灌流液(mmol/L:120 NaCl、 25 NaHCO3、 4.7 KCl、 1.2 MgSO4、 1.2 KH2PO4、 1.25 CaCl2、 11 glucose)中行主动脉逆行恒流(6 ml/min)灌流。预灌流15 min后再持续灌流60 min。左心室置留球囊导管,经换能器在生理多道记录仪上记录左心室内压最大变化速率(±LVdp/dtmax)。

将健康对照动物和ISO模型组动物的心脏各随机等分为加Adm (灌流液内加Adm 5×10－５ mol/L)和不加Adm的四组(n=12)。

1.3 心肌肌浆网(sarcoplasmic reticulum, SR)膜制备与细胞标志酶测定心脏灌流结束后, 按Osada方法［5］差速离心制备大鼠心肌细胞SR膜。两个心脏的左心室心肌合在一起制备SR,将SR膜悬浮于缓冲液(mmol/L: 250 sucrose, 10 histidine)中, 以Lowry法［6］测定SR膜悬液蛋白含量,同时参照文献［5,8］测定SR膜悬液中哇巴因敏感的Na+-K+-ATP酶(肌纤维细胞膜标志酶)、葡萄糖-6-磷酸酶(微粒体标志酶)和细胞色素c氧化酶(线粒体标志酶)活性,以鉴定SR膜的纯度。

1.4 心肌SR钙摄取与释放量测定心肌SR钙摄取量测定参考文献［5］: 取定量SR膜2份, 分别加入含Tris-ATP和不含Tris-ATP的反应液,终体积均为1 ml, 37℃预孵育。参照游离钙浓度计算软盘提供的数据, 加入 ~45CaCl2启动SR钙摄取反应。 反应结束时, 取200 μl反应混合液置于0.45μm微孔滤膜上; 经Millipore抽滤, 以加和不加ATP反应液的滤膜 ~45Ca2+放射活性之差代表ATP依赖的SR ~45Ca2+摄取量, 结果以nmol~45Ca2+/mg protein·min－１表示。

心肌SR钙释放速率测定［7］：取定量SR膜悬浮于释放反应液中, 在室温下加入10 μmmol/L ~45CaCl2?(0.74 GBq/L), 5 mmol/L aTP共孵育45 min; 再加入1 mmol/L EGTA反应15 s。 反应结束时测定EGTA诱导的钙释放速率, 结果以nmol ~45Ca2+/mg protein表示。

1.５ 心肌SR Ca2+-ATPase活性测定按Jones［8］等的方法将SR膜10 μg加入1 ml反应液中,参照游离钙浓度计算软盘提供的数据加入CaCl2(对照组不加CaCl2), 37℃水浴振荡10 min后加入Tris-ATP启动反应, 20 min后比色定量测定游离无机磷酸含量, 以加和不加钙两组比色之差表示SR的Ca2+-ATPase活性。

1.６ 心肌SR ryanodine受体结合分析根据Inui改良方法［9］, 将SR膜40 μg加入反应液(mmol/L: 120 KCl、 20 HEPES、0.5 EGTA、 300 NaCl、 pH 7.2)中, 加入 ~3H-ryanodine 1~40 nmol/L, 反应终体积为200 μl,于37℃孵育30 min。非特异性结合管中加入10 μmol/L未标记的ryanodine。实验结束时, 将反应液迅速通过0.45 μm微孔滤膜,用PBS冲洗3次; 滤膜干燥后加入闪烁液, 用液体闪烁计数仪测定 ~3H放射活性; 总结合量与非特异性结合量之差即为 ~3H-ryanodine受体结合量, 作Schatchart图计算ryanodine受体结合Bmax和Kd值。

1.7 试剂与实验动物 ~3H-ryanodine (3.7TBq/mmol)、 ~45CaCl2? (370GBq/g) 购自NEN Du Pout, ryanodine、 histidine、 NaN3、 HEPES和Tris-ATP等购自Sigma, ISO、 Adm购自Phoenix pharmaceuticals, 其余试剂为国产分析纯。Wistar雄性大鼠由北京医科大学实验动物中心提供。

1.8 统计学处理实验结果以mean±SD表示, 以组间t检验和配对资料t检验进行显著性检验。

2结果

2.1 Adm对ISO大鼠心功能的保护作用

经皮下注射ISO导致大_笮募∶飨运鹕? 表现在灌流左心室内压最大变化速率+LVdp/dtmax降低25.8% (P＜0.01), -LVdp/dtmax降低46.5%(P＜0.01)。Adm单用时左室dp/dtmax虽较对照组略高(分别较对照组高8.4%和9.8%),但无统计学意义(P＞0.05)。Adm能明显改善ISO引起的心肌损伤。ISO+Adm组与ISO组相比: 经Adm灌流后+LVdp/dtmax增加16.9%(P＜0.05),-LVdp/dtmax增加29.2%(P＜0.05)。

2.2 心肌SR膜纯度鉴定

心肌SR膜液中哇巴因敏感的Na+-K+-ATPase (肌纤维细胞膜标志酶)和细胞色素c氧化酶(线粒体标志酶)活性均较大鼠心肌匀浆液中的活性有所降低,对照组SR的分离系数分别为0.8和0.4; 而葡萄糖-6-磷酸酶活性增加, 对照组SR的分离系数为7.5。同样ISO组SR Na+-K+-ATPase和细胞色素c氧化酶的分离系数为0.9和0.5,葡萄糖-6-磷酸酶分离系数为6.5。说明所分离心肌SR纯度较高, 细胞浆膜和线粒体污染较少。

2.3 心肌SR钙摄取与释放

iSO诱导大鼠心肌损伤坏死后, 心肌SR Ca2+摄取和释放较对照组分别减少80.3%(P＜0.01)和70.9%(P＜0.01); Adm单用增加肌浆网Ca2+释放; adm能明显改善ISO诱导的大鼠心肌SR Ca2+摄取和释放, 与不加Adm组比较分别增加23.0% (P＜0.01)和43.5% (P＜0.01)(表3)。

2.4 心肌SR ~3H-ryanodine受体结合

iSO诱导大鼠心肌损伤坏死后, 心脏SR ~3H-ryanodine受体最大结合量(Bmax)较对照组减少28.3% (P＜0.01), Adm灌流后则较ISO组心脏SR的Bmax增加42.2%(P＜0.05),但 ~3H-ryanodine受体的平衡解离常数Kd值改变不大。

2.5 心肌SR Ca2+-ATPase活性

iSO 诱导大鼠心肌损伤坏死后, 心脏 SR Ca2+-ATPase 较对照组 SR 减少 46.0% (P＜0.01), Adm 灌流后则较 ISO 组心脏 sR 增加 24.2% (P＜0.01)。

3讨论

大鼠经ISO诱导后, 心肌出现局灶性损伤和坏死, 心肌纤维排列紊乱, 肌浆内水肿, 坏死灶之间相互桥接,胞核聚集。心功能表现为收缩与舒张功能下降。本工作观察到, ISO组±LVdp/dtmax下降, 与文献报道一致［3］。

我们观察到, Adm能显著增加ISO大鼠左室收缩期和舒张期dp/dtmax, 表明Adm对ISO所致的大鼠心肌损伤具有明显的保护作用,心功能明显改善。这一结果与杨军等［3］的实验结果一致。他们的实验是在整体动物上进行的, 由于Adm具有很强的利钠利尿, 扩血管作用而使心脏的前后负荷减轻,所以不能反映Adm直接的心脏作用。本工作在离体灌流的大鼠心脏模型上证明了Adm直接的心脏保护作用。

心肌细胞兴奋时, 细胞外Ca2+内流诱发SR的终末池向胞浆释放Ca2+, 称之为钙触发的钙释放(calcium induced calcium release), 是心肌兴奋-收缩耦联的始动环节。心肌SR Ca2+触发的钙释放主要受终末池上Ca2+通道ryanodine受体的控制。ryanodine受体被激活后,贮存在SR中的Ca2+大量释放进入胞浆, 与肌钙蛋白结合, 引起肌原纤维收缩。在心肌细胞复极化时, SR膜上的Ca2+泵, 在Mg2+和Ca2+存在下,分解ATP获得能量, 逆浓度梯度将胞浆内Ca2+转运至SR中, Ca2+与肌钙蛋白解离, 肌原纤维舒张。所以, sR对Ca2+的摄取和释放直接影响心脏的收缩和舒张功能。Adm的扩血管降压作用主要通过G蛋白耦联受体激活cAMP/PKA途径实现［10］。Szokodi等［11］发现, adm亦可通过ryanodine受体敏感的钙离子释放通道释放Ca2+和thapsigargin敏感的Ca2+贮存, PKC的激活增加心脏收缩力。本实验观察到, adm单用时增加心肌SR钙释放和 ~3H-ryanodine受体结合位点。同时<