摘要：为大规模鉴定哺乳动物神经系统新基因的功能,利用反义核酸技术建立了一个小鼠行为学检测平台。从大鼠脑低丰度表达基因的cDNA亚库中挑选出在大鼠脑内表达的20个基因,设计并合成了这些基因的小鼠同源基因的特异性反义核酸。用Hamilton微量注射器将反义核酸注射到小鼠的侧脑室,并以注射生理盐水和随机序列核酸组作为对照。小鼠的行为学检测模型为: 考察日常代谢能力的摄食量, 考察Locomotion activity (移动)的旷场行为,考察疼痛阈值的甩尾试验和记忆能力的步下法实验。结果显示, 上述20个基因中的14个在不同行为学模型中与对照组有显著性差异。以美国为首的“人类基因组计划”的DNA序列测定部分即将完成。而基因的DNA序列信息仅是基因资源开发的第一步, 更重要的是基因的功能信息,特别是与人类重大疾病和重要生理功能有关的基因信息, 有着巨大的应用与开发价值。一个以基因组功能研究为主要内容的功能基因组学 (Functional genomics) 时代即将到来。我国人类基因组研究近年来已取得重大的进展, 随着研究的深入, 建立大规模功能基因筛选系统已成为亟待解决的问题,这对于使我国的人类基因组研究及时转入功能基因组研究阶段将发挥重要的作用。另一方面, 随着人类疾病基因的定位克隆,也需要功能研究来验证。而基因功能方面的研究在国内开展还不多, 大部分是在细胞水平上的研究, 在动物整体和活体水平上开展这方面的研究工作就更为罕见。

本研究旨在建立以哺乳动物中枢神经系统为主的基因功能规模化研究的动物行为学检测平台, 将反义核酸技术与动物行为学实验方法相结合, 用于大量初步筛选、鉴定新基因与中枢神经系统活动相关的功能, 从而为这些相关基因的深入研究奠定基础。我们在构建了上述小鼠行为学检测平台的基础上,初筛了最近国际上发现的未知功能或功能不明确的20个基因,从中分析该行为学检测平台在基因功能筛选中的作用。初筛中已发现的部分具有显著功能表现的基因研究情况将另文发表。

1材料和方法

1.1 材料成年大鼠脑cDNA文库为Gibco公司产品; 反义核酸由上海生工公司合成; 进口Hamilton 微量注射器,国产不锈钢代谢笼、水浴锅、步下测试仪等。实验动物为近交系BALB/c小鼠, 雄性(20～22 g), 清洁级, 购自中国科学院上海实验动物中心。

1.2 反义核酸的设计与合成利用生物信息学方法, 在所选取基因cDNA序列的翻译起始区或其它区域挑选长度为20的核苷酸序列,设计并合成反义核酸。随机序裂核酸(scramble)的设计是将该序列经核酸数据库搜寻无同源性序列后再确定的。

1.3 反义核酸动物活体注射每种反义核酸用10～18只小鼠,生理盐水对照组和随机序列核酸对照组各用10～20只小鼠。将不同基因的反义核酸溶于生理盐水至终浓度0. 5 μg/μl, 分别定量注入麻醉后小鼠的侧脑室(每次4μl, 每1～2天注射1次, 共注射3次), 并设生理盐水组和随机序列核酸组作为对照。每组行为学实验完成后, 在反义核酸注射部位注入蓝墨水, 并做脑切片检查,以确认注射部位的准确性。

1.4 小鼠行为学实验

1.4.1 每日摄食量每日测定实验小鼠的体重, 用代谢笼测定小鼠每日的摄食量。

1.4.2 旷场行为(Open field behavior)［1］将实验小鼠放置于26 cm×16 cm×13 cm的长方形实验盒内,底部均分为6格(2×3), 分别观察并记录3 min内小鼠行走的格数和直立的次数。为了减少小鼠刚进入新环境时行为与正常状态的差异,参照有关文献改进为连续测定4次, 每次间隔3 min, 取后3次的数据计算平均数用于统计。

1.4.3 甩尾试验(Tail flick latency)［2,3］用一块软布轻轻裹住实验小鼠的身躯仅露出尾巴,使之不能逃脱又不至于太难受。将鼠尾尖端约1.5 cm部分浸入53℃的水浴内, 同时用秒表测出鼠尾从浸入到甩出水面的时间(精确到0.1 s)。连续做4次,每次间隔30 s。取后3次的数据计算平均数用于统计。

1.4.4 步下法(Step down test)［1］实验装置为20 cm×20 cm×30 cm的透明塑料箱, 箱底为金属电路板, 左角放置一个8 cm×8 cm×1.5 cm的平台为安全区。实验开始前先进行训练: 将小鼠放入实验箱内自由活动1 min, 然后将小鼠轻轻赶上小平台(一般情况下小鼠很快会从平台上下来),记录小鼠从完全登上小平台到下来时的秒数(潜伏期)。连续重复3次后, 再将小鼠赶上小平台, 并将箱底的电路板立即通电(50 V, 0.5 mA)。当小鼠再次跳下小平台受到电击后, 即跳回平台以逃避电击, 此时则视为训练完毕, 将小鼠取出放回饲养笼。训练后24 h再将小鼠放入实验箱内的小平台上,箱底的电路板不通电, 记录小鼠从放上小平台到下来的秒数。训练后48 h再同样记录一次时间。为了更好地观察和评价动物的记忆行为, 参照有关文献增加了训练次数和48 h后的观察。

1.5小鼠行为学检测平台的建立根据所测基因产物的细胞内定位, 可将小鼠行为学实验的周期分为两类: (1)基因产物定位于细胞内。第1日: 注射反义核酸。第2日:注射反义核酸。第3日: 注射反义核酸, 约3 h后进行步下法训练。第4日: 旷场行为试验, 甩尾试验, 间隔约2 h后进行步下法试验。第5日: 步下法试验,结束后在反义核酸注射部位注入蓝墨水, 并做脑切片检查, 以确认注射部位的准确性。(2)基因产物定位于细胞表面。第1日: 注射反义核酸。第3日:注射反义核酸。第5日: 注射反义核酸, 约3 h后进行步下法训练。第6日: 旷场行为试验, 甩尾试验, 间隔约2 h后进行步下法试验。第7日: 步下法试验,结束后在反义核酸注射部位注入蓝墨水, 并做脑切片检查, 以确认注射部位的准确性。

1.6 统计学分析将实验组的行为学特征与对照组比较, 并以t检验法进行生物学统计分析［4］。

2结果

2.1 反义核酸的设计与合成

以成年大鼠脑cDNA文库为基础, 利用差异筛选方法建立了一个大鼠脑低丰度表达基因的cDNA亚库。结合随机测序与生物信息学分析,从上述低丰度表达基因亚库中挑选出在大鼠脑内表达的20个基因(基因编号1～20), 其中包括: 转录调控因子、 信号转导分子、轴突生长及神经元活动相关蛋白等不同类型的基因, 设计并合成了这些基因的特异性反义核酸, 将其用于小鼠行为学实验。

2.2 神经系统功能基因小鼠行为学检测平台的建立

本研究共进行了20种不同基因反义核酸的实验, 每种反义核酸使用10～18只小鼠; 对照组为随机序列核酸以及生理盐水,每组10～20只小鼠。随机序列核酸组与生理盐水组在各个行为学模型上均无显著差异, 与生理盐水组同为对照组。20种反义核酸及两种对照组共使用实验小鼠266只。

2.3 神经系统功能基因小鼠行为学检测平台的应用

初筛实验结果经t检验后显示: 在20种反义核这14种反义核酸中, 与旷场行为中的跨格行为(step across)有关的有5种,与旷场行为中的直立行为(standing up)有关的有11种, 而与跨格和直立均有关的有4种; 与痛觉(甩尾)试验有关的有4种,与记忆(步下法试验)有关的有2种。

no.13反义核酸实验组和对照组的旷场行为比较。No.13实验组小鼠的移动减慢, 尤其是直立行为与2个对照组相比,均减少到差异极显著的地步(P＜0.001)。这预示着No.13基因可能与小鼠的移动能力(locomotion activity)有关。

no.8反义核酸实验组和对照组的步下法试验结果比较。No.8反义核酸使小鼠的记忆丧失至与对照组差异极显著的程度(24 h)。因此, no.8基因极可能具有增强记忆的功能, 值得进一步深入研究。

甩尾试验是考察疼痛阈值的实验。No.18反义核酸实验组和对照组的甩尾试验结果比较, 实验组的甩尾时间比对照组的甩尾时间短, 且统计结果为有差异(P＜0.05),意味着反义核酸使小鼠对痛觉的敏感度提高了。

3讨论

建立整体动物行为学检测和功能阻断相结合的基因功能筛选方法, 是在“人类基因组”研究中寻找新基因功能的一个比较有效的筛选策略。本筛选策略的实施,能为被测基因与整体功能之间的因果关系提供重要信息, 具有指导基因功能研究向纵深发展的实际意义。对于动物整体来说,为了存活, 新陈代谢、 学习记忆、 感觉(受)、活动能力、 生长、 睡眠等都是综合性指标, 不管哪些部分生理功能发生变化, 均可能在这几大类指标中反映出来。在此基础上,其它方面的动物行为学检测指标还可以增加。得到这些信息能提供一个向纵深研究具体基因功能的整体功能信息平台, 推动各基因功能研究向纵深发展。同时,动物行为学检测平台的建立, 也为转基因动物和基因剔除动物的表型研究这一困惑国内外研究工作者多年的难题, 提供了技术方法系统。

利用反义核酸技术对基因表达进行阻断, 再通过对动物行为的观察来研究基因功能, 是目前国际上的较为流行的实验方法［5］。为了提高实验的效率以利于较大规模的筛选,作者采用了个体较小, 品系众多, 与人类又具有遗传同源性的小鼠作为实验动物; 使用Hamilton微量注射器能精确定量并连续注射,比使用微型渗透压泵省时还能降低成本。在初筛的20个基因中, 已经发现有14种与对照组在不同的行为学模型上存在不同程度的差异, 差异非常显著的有5种,说明了这一动物行为学检测平台的实用性。

实验小鼠存在很多不同品系［6］, 它们的来源和遗传背景都有着不同程度的差异, 在行为学上也表现不一［7,8］。如果能进一步用不同品系重复这些实验而所得结果类似,就更说明了这一结果的可信性; 反之, 如不同品系重<