摘要：本文用组织化学、电镜以及肌球蛋白和肌动蛋白电泳分析等方法分析了在单纯性面神经切断和三叉神经、面神经同时切断后面肌萎缩的病理改变肌纤维的显微结构改变以及面肌收缩蛋白质在手术后不同时期的降解变化。实验证明,面部肌肉在不同的神经切断情况下其病理改变不同, 正常的三叉神经支配可以延缓面瘫后肌肉蛋白质的降解, 减少胶原纤维结缔组织的增生, 较好地保护肌纤维的显微结构,延缓和减轻去运动神经支配面肌肌萎缩。本研究结果可以为临床治疗面瘫提供一定的理论指导。肌肉失去运动神经支配后, 蛋白水解酶活性升高, 肌肉蛋白降解增加。Jakubiec-Puka[1~4]发现, 肌肉去神经支配后,肌球蛋白重链最早出现降解, 且损伤程度重; 肌动蛋白虽然也有降解, 但降解较缓慢且程度轻, 肌球蛋白与肌动蛋白之比降低。肌肉得到神经再支配后,肌球蛋白的合成增加, 而肌动蛋白的增加却不明显。已有的研究表明：去神经后的面部肌肉萎缩不同于肢体肌肉, 面部肌肉萎缩慢, 程度轻。Bardosi[5]等观察了病程从1个月至36年的面瘫病人电镜下的面肌的病理改变, 所有的病例均表现了去神经支配后的典型病变, 但是, 病理变化与病程长短并无明显相关性,即晚期面瘫病人其面肌仍保持相对完整的组织结构, 并没有发生纤维萎缩。Ochi等[6]在感觉神经节移植对去神经支配肌肉萎缩的影响研究中发现,通过感觉神经节的移植可以延缓去神经支配肌肉的萎缩。面部感觉神经分布丰富,面部肌肉去神经支配后肌萎缩的特殊变化是否与面部丰富的三叉神经分布有关尚不清楚。本实验的目的旨在探讨三叉神经对面部肌肉去运动神经支配后肌球蛋白与肌动蛋白变化的影响。

1材料和方法

1.1 动物模型的建立 于兔颅顶部开颅, 在脑桥中部寻找三叉神经根, 沿三叉神经走向解剖该神经的分布范围。面部深层感觉由三叉神经的上颌神经及下颌神经支配,因此, 阻断上颌神经和下颌神经即能达到实验要求。上颌神经可在摘除眼球后, 于眶底处暴露并切断;下颌神经可于颞骨乳突和下颌支处暴露并切断。面神经的阻断可于茎乳孔处暴露并切断。面神经、三叉神经切断均为单侧。术后饲养需连续给予抗菌素3 d。考虑到摘除眼球不影响上唇提肌的实验结果, 本实验使用的正常神经支配对照均为未摘除眼球的正常兔。

取大白兔26只, 均为雌性, 给予相同的饲料喂养, 将大白兔分为三组。 Ⅰ组：正常神经支配(2只); Ⅱ组：单纯切断面神经(12只);Ⅲ组：同时切断面神经和三叉神经(12只)。 分别于术后1、2、4、6、8、12周取上唇提肌, 置于－20℃冰箱保存, 以备实验用。

1.2 肌肉组织HE染色 配制Mayer酸性苏木素液和水溶性伊红染液; 分别将不同时间段取样的实验组和对照组的肌肉组织切片, 厚度为10 μm。苏木精液染 10 min, 水冲洗; 伊红液染10 min, 水冲洗; 酒精脱水, 二甲苯透明, 封片。

1.3 肌肉蛋白质的SDS-PAGE分析 取0.3 g上唇提肌, 用组织匀浆机搅碎肌肉组织, 加1.5 ml缓冲液(0.15 mol/L、pH 6.5磷酸缓冲液, 内含0.3 mmol/L KCl和0.01 mmol/L MgCl2), 用12倍体积水稀释, 过滤, 10000 r/m低温离心20 min;上清再加20倍体积水, 冰浴24 h, 再低温离心; 沉淀用缓冲液溶解(0.15 mol/L, pH 6.5磷酸缓冲液内含1 mmol/L KCl和1 mmol/L na2CO3), 蛋白质浓度用紫外280 nm吸收值读数确定, 各样品均用上述缓冲液稀释成同一浓度, 取15 μl样品, 用分离胶浓度为10%或12%的SDS-PAGE进行凝胶电泳分析。用GDS-8000凝胶电泳分析仪分析电泳结果。以电泳板底色为标准,测量每一条带的光密度。每一组标本进行5次凝胶电泳分析。

1.4 电镜观察肌肉标本于面颊部暴露上唇提肌, 切取肌肉7 mm×1 mm×1 mm的组织块, 用常规方法进行戊二醛和锇酸双重固定, 丙酮脱水, EPON812包埋, LKB-5型超薄切片机切片, 然后用硝酸铅、醋酸铅和柠檬酸铅混合染色, 在ZEIZZ-EM902透射电镜下进行观察。

2结果

2.1 肌肉组织的形态学变化

与对照组相比(对照组结果未显示), 术后1～2周, 第Ⅱ、Ⅲ组肌肉纤维均发生萎缩, 但程度较轻, 仅有个别肌纤维横径变小, 出现角形肌纤维, 肌细胞核聚集,肌纤维之间有少量胶原纤维增生, 两组之间变化无明显区别。4周以后, 第Ⅲ组肌纤维的萎缩明显严重于第Ⅱ组, 术后第6至12周时,第Ⅲ组肌肉组织切片可以看到大量的萎缩肌纤维, 肌纤维横径变小, 肿胀与萎缩的肌纤维并存, 肌细胞核聚集, 有大量的角形纤维,肌纤维之间有较多的结缔组织存在。而第Ⅱ组肌纤维的萎缩相对较轻, 肌束之间及肌纤维之间胶原结缔组织增生较少。

2.2 肌肉蛋白质分析

2.2.1 肌球蛋白重链的变化面部肌肉在失去神经支配1周时, 两个实验组肌球蛋白重链的含量与正常神经支配组即有明显差别, 两个实验组蛋白质降解较明显。但是,两个实验组肌球蛋白重链的含量也已有明显差别。在肌肉去神经2周以后, 两个实验组肌球蛋白重链的含量与正常神经支配组以及两个试验组之间始终存在明显差别。第Ⅲ组肌球蛋白重链的含量比第Ⅱ组少, 第Ⅲ组肌球蛋白重链的降解速度明显快于第Ⅱ组。

2.2.2 肌动蛋白的变化面部肌肉去神经支配1周时, 两个实验组肌动蛋白的含量与正常神经支配组之间没有明显差别。肌肉去神经支配2周以后,不仅两个实验组肌动蛋白的含量与正常神经支配组有明显差别, 而且, 两个实验组之间肌动蛋白的含量也存在明显差别, 即两个实验组肌动蛋白的含量较正常神经支配组低,第Ⅲ 组肌动蛋白的含量比第Ⅱ组低, 两个实验组肌动蛋白明显降解, 第Ⅲ 组肌动蛋白的降解速度明显快于第Ⅱ组。

2.2.3 肌球蛋白与肌动蛋白之比(M/A)的变化正常上唇提肌肌球蛋白与肌动蛋白之比(M/A)为2.49。肌肉去神经支配1、2周后,两个实验组肌球蛋白与肌动蛋白之比与正常神经支配组之间有明显差别, 两个实验组肌球蛋白与肌动蛋白之比降低, 即肌球蛋白的降解速度比肌动蛋白的降解速度快,但是两个实验组之间肌球蛋白与肌动蛋白之比却没有明显差别。肌肉去神经支配4、6周后, 两个实验组肌球蛋白与肌动蛋白之比与正常神经支配组之间也存在明显差别,两个实验组肌球蛋白与肌动蛋白之比开始大于正常神经支配组, 说明两个实验组肌动蛋白的降解速度大于肌球蛋白的降解速度。肌肉去神经支配8周后,两个实验组肌球蛋白与肌动蛋白之比与正常神经支配组之间依然存在明显差别, 而此时两个实验组肌球蛋白与肌动蛋白之比又低于正常神经支配组,即肌球蛋白的降解速度又快于肌动蛋白的降解。肌肉去神经支配4周以后, 两个实验组之间肌球蛋白与肌动蛋白之比有明显差别,第Ⅲ组肌球蛋白与肌动蛋白之比(M/A)始终小于第Ⅱ组, 即第Ⅲ组肌球蛋白的降解比第Ⅱ组肌球蛋白的降解相对快。

2. 3 显微结构的变化

2.3.1 正常兔上唇提肌的显微结构呈典型横纹肌特征, 纵切面可见规律性的肌横纹结构, 横断面呈规律性排列的点状结构。

2.3.2 肌肉去神经支配后兔上唇提肌显微结构的变化

2.3.2.1 面神经和三叉神经同时切断后兔上唇提肌显微结构的变化

(1) 肌纤维纵切面观察 单纯面神经切断1周后, 肌横纹无明显变化, 肌丝密集, 排列整齐; 术后2周, A带、I带屈光性没有改变, 带与带之间界限清晰,肌丝排列整齐, 但是局部变疏, 密度降低; 术后4周, 肌丝排列出现紊乱, 密度明显降低, M线变得模糊, A带与I带的对比度降低, Z线无明显变化;手术6周以后, 肌纤维明显变细, 肌丝排列紊乱加重, 肌丝稀疏, M线逐渐消失, A带与I带已不能分辨; Z线也变得不规整。

(2) 肌纤维横断面观察 术后1周, 肌球蛋白和肌动蛋白的点状排列规整, 未见点状结构的缺失。术后2周, 偶见粗肌丝(肌球蛋白)缺失,细肌丝(肌动蛋白)未见缺失, 粗、细肌丝排列整齐。术后4~6周, 粗肌丝缺失增多, 而细肌丝的缺失较粗肌丝的缺失更明显, 肌丝的排列也出现紊乱。术后8~12周,又表现为粗肌丝的缺失较细肌丝的缺失明显, 而粗、细肌丝的排列紊乱也较明显。

2.3.2.2 单纯面神经切断后兔上唇提肌显微结构的变化肌球蛋白和肌动蛋白的变化与面神经和三叉神经同时阻断后的变化相似, 但是病变程度轻, 肌横纹消失的时间晚,肌丝缺失程度轻, 粗、细肌丝排列紊乱程度也较轻。

3讨论

肌肉蛋白中的肌球蛋白和肌动蛋白是主要行使收缩功能的蛋白质, 具有足够量的肌肉收缩蛋白方能保证肌肉功能的完成。去神经支配后, 蛋白水解酶的活性升高,肌肉蛋白降解增加, 致使肌纤维横径变细, 肌肉收缩力量降低。通过实验我们发现, 正常的三叉神经支配, 可以使面部肌肉在去神经支配后, 肌肉收缩蛋白降解速度变缓,这为神经再支配肌肉功能的恢复奠定了基础。

以往的研究表明, 感觉神经可以减轻肌肉去神经支配后的肌萎缩。Hynes[7]通过将感觉神经与运动神经吻合,去神经支配的肌肉萎缩减轻。Ochi[6]通过将感觉神经节移植于去神经肌肉内, 肌肉的萎缩同样明显减轻, 本文报道的实验结果与这些实验结果相吻合。不论是感觉神经,还是运动神经都对其所支配的靶器官具有神经营养作用。运动神经使其所支配的肌肉维持正常的生理功能与代谢活动, 感觉神经也能起到一定的作用,失去感觉神经支配的皮肤会变薄。神经元通过轴浆运输不断地将神经元合成的物质运达靶器官, 从而对靶器官提供营养支持作用。面部表情肌的深感觉来源于上颌神经和下颌神经,两者之间构成了神经元与靶器官的有机整体, 不难设想, 丰富的感觉神经为表情肌提供了营养支持。Vergani[8]通过系统地给予去神经肌肉胰岛素样生<