摘要：实验用多管微电极细胞外记录氨基甲酸乙酯麻醉的SD大鼠延髓头端腹外侧区(RVLM)神经元的活动。用电刺激主动脉神经和静脉注射苯肾上腺素激活压力感受器反射等方法鉴定心血管神经元,在RVLM内共记录到145个自发放电的神经元, 其中33个为心血管神经元, 31个为伤害调制性神经元,81个为未知功能神经元。33个心血管神经元微电泳硫酸皮质酮(CORT)后, 25个(76%)神经元放电迅速加快,8个(24%)自发放电没有变化。伤害刺激引起兴奋的31个伤害调制性神经元, 微电泳CORT后19个 (64%)神经元放电抑制, 而2个 (6%)兴奋,其余10个(30%)没有反应。功能不明的81个神经元在微电泳CORT后, 32个(40%)兴奋, 5个(6%)抑制, 44个(54%)没有反应。以上结果证明CORT可能通过非基因组机制快速影响RVLM神经元的活动,提示在应激等情况下CORT的快速作用机制可能在心血管和抗伤害等活动整合中具有一定意义。一般认为糖皮质激素(glucocorticoids, GC)通过与细胞内受体结合, 调节基因表达和蛋白质的合成, 从而发挥缓慢、持久的基因组效应［1］。但大量的研究证实GC还可能由膜受体介导的快速非基因组机制［2,3］,但这种非基因组机制在生理病理学上的意义尚不清楚。脑内微量注射GC可引起心血管功能和交感神经活动的改变, 延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateral medulla, RVLM)微量注射皮质酮(corticosterone, CORT), 可引起快速的心血管功能改变, gC可能通过其非基因组机制参与心血管功能的调节［4］。RVLM的解剖和功能十分复杂, RVLM心血管神经元在交感神经系统和心血管活动的整合中具有关键的作用, rVLM也有一些神经元在呼吸、 抗伤害等活动的调节中起重要的作用［5,6］。 但由于微量注射方法难以证明GC对不同类型神经元的作用特点,因此本研究试图通过细胞外记录和微电泳的方法, 观察CORT对RVLM内心血管和非心血管神经元(伤害调制性等神经元)的作用特点,探讨其在调节心血管功能及某些非心血管功能(如抗伤害)中的意义。

1材料和方法

1.1 手术处理雄性SD大鼠(250～400 g), 腹腔注射戊巴比妥钠60 mg/kg作诱导麻醉, 作气管插管和右股动脉、 股静脉插管,动脉导管连接压力传感器用计算机(PC486)记录血压。动物取俯卧位, 头部固定于脑立体定位仪(Narishige)上, 静脉推注1%三碘季铵酚(每隔1 h注射4 mg/kg)制动, 人工通气 (10～12 ml/kg , 60～70次/min), 补充20%氨基甲酸乙酯维持麻醉(静脉注射1 g/kg, 根据动物血压、心率的平稳状况及刺激后肢血压变化等指标适当补充)。切开颅顶至背部正中皮肤, 分离主动脉神经(aortic nerve, AN), 充分暴露延髓背面,调整延髓背面呈水平位。以琼脂生理盐水棉球将创面周围围起成一池状, 将AN挂在银丝刺激电极上,池中倒入温液状石蜡。整个实验过程中终末潮气的CO2浓度维持在4%～5%, 直肠温度维持在37℃左右。

1.2 细胞外记录自制四管玻璃微电极, 其中一管记录电极内灌入3%滂胺天蓝(pontamine sky blue, PSB)-0.5 mol/L醋酸钠溶液,阻抗为4～10 MΩ, 其它三管分别灌入: 0.1 mol/L谷氨酸钠(glutamate, GLU), 0.05 mol/L硫酸皮质酮(corticosterone sulfate, CORT)和2 mol/L NaCl。以延髓闩部(Obex)为参考点, 在RVLM (向前2.6～3.0 mm, 旁开1.6～2.0 mm,延髓背侧表面向下2.8～3.4 mm)记录神经元的自发放电活动, 信号经放大器(Nihon Kohden, MEZ-8210)放大(通过频率100～3*#000 hz)后用时程-幅度窗口鉴别器(中国科学院上海生理研究所, TAWD-94)鉴别单一神经元的动作电位, 使之整形成1 ms的标准方波,输入计算机进行频率积分。当记录到一个RVLM自发放电神经元单位后, 首先微电泳GLU (0～－60 nA), 如果神经元自发放电增加,说明记录的可能是神经元胞体的动作电位, 再作进一步观察; 如果自发放电没有变化, 则可能记录在离胞体较远的部位［7］, 这种神经元被放弃。

1.3 RVLM心血管神经元的鉴定标准与方法［8］(1)刺激AN时记录的RVLM神经元的放电被抑制。通过电生理刺激器(Nihon Kohden, sEN-7103)对AN进行低频短串刺激(波宽200 μs,强度为0.2～0.8 mA, 间隔5 ms, 串长3, 串频1 Hz),经过计算机叠加(300次)处理后观察刺激AN前后神经元放电频率的变化。(2) 神经元活动可被升高血压所抑制。静脉一次性注射苯肾上腺素(10 μg/kg),同步观察血压和神经元放电的变化。(3) 神经元自发放电活动呈心性节律: 用心电图的R波触发计算机分别对动脉脉搏波和神经信号作平均和叠加(300次)处理,观察神经元在一个或数个心动周期内神经元放电频率的变化。

我们将不符合上述特性的神经元都归纳为非心血管神经元, 同时对它们的性质进行初步的分析。伤害刺激(有齿镊钳夹动物同侧后肢皮肤, 5～20 s)后放电迅速增加的神经元, 被认为是伤害调制性神经元。与上述特性无关的神经元统称为功能不明的神经元。

1.4 微电泳在确定了神经元的性质(心血管神经元或非心血管神经元)后, 通过多功能微电泳系统(中国科学院上海生理研究所, mIS9400)观察微电泳不同药物对神经元自发放电活动的影响。CORT、 GLU用负电流, 电泳时间一般为1 min左右, 两次电泳的间隔约2 min,电泳间隔期药物管均给予保持电流(8 nA, 极性与电泳电流相反), 防止药物外溢。

1.5 统计学处理神经元放电频率用Mean±SD表示, 微电泳后的放电频率变化超过20%认为有意义, 单位放电变化用配对t检验。

1.6 药品 CORT、 GLU、 三碘季铵酚购自Sigma公司。2结果

2.1 微电泳CORT对RVLM心血管神经元放电频率的影响

在RVLM共记录了145个神经元, 基础放电频率为1～34次/s (16.1±6.2次/s, n=145)。其中33个为心血管神经元,基础放电频率为3～25次/s (14.1±4.3次/s, n=33), 微电泳CORT后25个单位 (76%) 放电频率迅速加快 , 作用潜伏期1～54 s(25±7.9 s)。这25个单位, 微电泳CORT前的基础放电频率平均值为12.7±2.9次/s, 以30、 60和 90 nA 电流微电泳 CORT,放电频率分别增加至15.6±3.6、 18.0±3.9和20.9±4.4次/s (均P＜0.05, n=25), 平均增加22.8%、 41.7%和64.6%,微电泳停止后放电频率迅速恢复至对照水平。微电泳CORT后放电频率的变化不伴有动作电位波形或幅度的变化, 在这些神经元,对照电流也不能使神经元放电频率发生明显变化。余8个心血管神经元, 对微电泳CORT (最大电泳电流达120 nA)没有明显反应。可被CORT兴奋的心血管神经元与不被兴奋的心血管神经元在基础放电型式、频率和对GLU的敏感性等特征上是相似的。

2.2微电泳CORT对RVLM非心血管神经元放电频率的影响

在RVLM共记录了112个非心血管神经元, 基础放电频率为1～34次/s(17.1±5.8次/s, n=112)。31个神经元的放电在伤害刺激后快速兴奋,被认为是伤害调制性神经元, 其中19个(64%)伤害调制性神经元微电泳CORT后放电频率迅速降低, 微电泳CORT前的基础放电频率平均值为14.7±3.4次/s,以30、 60和90 nA电流微电泳CORT, 放电频率平均值分别显著降低至11.2±2.9、 9.5±3.5和6.3±2.7次/s(P＜0.05, n=15), 平均降幅为23.8%、 35.4%和57.1%, 微电泳停止后放电频率迅速恢复至对照水平; 2个单位(6%)微电泳CORT后放电频率迅速加快,这种兴奋作用随着微电泳电流的增加而加强; 10个 (30%)在微电泳CORT后没有反应。81个功能不明确的神经元微电泳CORT后放电频率的变化呈多样性,40%的单位兴奋, 6%的单位抑制, 余54%的单位没有反应。CORT引起的神经元活动变化的潜伏期很短, 平均在30 s内,停止微电泳后神经元放电恢复期也较短, 在1 min以内。

2.3 被记录神经元在RVLM中的分布

实验结束时, 给神经元记录部位微电泳PSB (-15 μA, 10 min), 再用生理盐水100 ml和10%福尔马林溶液300 ml左心室灌流。取脑,10%福尔马林溶液固定, 延髓作50 μm的冠状冰冻切片, 在显微镜下寻找染点, 参照Paxinos and Watson图谱［9］,这些神经元均分布在面神经核尾极的后端, 疑核的下方(腹侧), 靠近延髓的腹侧面。但对CORT有反应和无反应的心血管神经元在RVLM中的分布无明显的差异,不同类型的神经元的分布也无明显的差别。

3讨论

本研究发现, 微电泳CORT后, 在很短的时间内(30 s内)神经元的放电频率即开始发生变化, 停止微电泳后放电即恢复至对照水平,这种作用不可能由基因组机制介导, 而只能用非基因组机制来解释。 我们注意到, 微电泳CORT引起的神经元放电的增加, 同微电泳电流的强度成正相关;在排除了电流直接作用后, 表明CORT的作用与神经元周围的CORT浓度有关, 提示本实验所观察到的效应可能是一种受体介导的特异性药理作用。也有作者报道RVLM微量注射CORT导致的心血管效应可能与乙酰胆碱受体有关［10］。但是至今尚没有纯化、 克隆出甾体激素的膜受体, 因此甾体激素快速作用的确切机制仍有待进一步阐明。

rVLM是交感神经活动和心血管功能调节的重要整合中枢, RVLM也是个功能十分复杂的神经解剖部位, 如参与呼吸调节、下行性抗伤害调制等重要功能活动［5,6,11,12］。 我们在本研究中发现CORT对大部分心血管神经元(76%)有快速兴奋作用, 这一结果支持Zhu等的报道,他们发现向大鼠RVLM微量注射皮质酮或醛固酮, 1～5 min后血压明显升高［4］。 我们先前的研究也发现静脉注射CORT也能快速增加RVLM心血管神经元的放电频率［13］。因此我们推测,应激时大量释放的GC, 可能通过非基因组效应快速兴奋RVLM的心血管神经元, 进而增强交感神经活动和心血管系统的功能。

部分RVLM神经元的活动与后肢的伤害刺激有密切的关系, 因此被认为可能是伤害调制性神经元［14］。作者还观察到少量神经元被伤害刺激所抑制(这类神经元未统