摘要：实验采用原子吸收分光光度法、 快速周期伏安法、高效液相电化学检测等方法,研究以6-羟基多巴(6-OHDA)制备的帕金森病(PD)模型大鼠黑质内铁含量的变化,铁对多巴胺(DA)能神经元的直接毒性作用以及铁离子螯合剂甲磺酸去铁胺的神经保护作用。结果发现: (1) PD大鼠损毁侧黑质内铁含量为非标准PD大鼠的3倍左右;(2) PD大鼠损毁侧纹状体内铁含量无明显改变; (3)单纯注射6-OHDA的大鼠其损毁侧纹状体(CPu) DA的释放量和含量均明显降低;(4)侧脑室预先注射甲磺酸去铁胺, 再重复上述实验, 损毁侧CPu DA释放量和含量均无明显改变; (5)单侧黑质内注射40 μg FeCl3后, 大鼠损毁侧CPu内DA释放量和含量显著降低。上述结果提示,6-OHDA可导致CPu DA释放量及含量减少, 此过程有铁的参与。由于铁可导致DA神经元死亡, 因此铁含量的增加可能是DA含量减少的原因之一,甲磺酸去铁胺具有保护DA神经元的作用。帕金森病(Parkinson′s disease, PD)是一种最常见的神经功能紊乱症, 也是老年期的多发病。 由于目前转基因、细胞移植等各种治疗方法尚不能治愈PD, 人们试图从不同的角度及病因学着手寻求新的防治措施［1,2］。PD最主要的病理学特征为黑质致密区(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺(dopamine, DA)能神经元退变及伴发的纹状体轴突末梢DA的耗竭。已有研究表明, 在PD病人SNc中有铁代谢的改变［3,4］,铁含量异常增高,并且存在氧化应激状态。脑部铁浓度异常升高引起的氧化应激以及可能存在抗氧化保护机制的缺失是神经元变性死亡的原因［5］。由于铁离子的细胞毒作用以及能促进羟自由基(hydroxyl, oH·)的生成, 使其在PD中的作用不容忽视。

本实验采用6-羟基多巴(6-hydroxydopamine, 6-OHDA)制备的PD大鼠模型, 研究中脑内DA水平与铁含量的关系,以及铁对DA神经元的直接毒性作用和铁离子螯合剂甲磺酸去铁胺(desferrioxamine mesylate, Desferal)对DA神经元的保护作用,以期对PD的病因学及药物治疗学研究提供新的实验依据。

1材料和方法

1.1 PD模型的制备和筛选成年雌性Wistar大鼠(180~220 g)以 8%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠头部固定在立体定位仪上,暴露颅骨后参照Paxinos和Watson［6］鼠脑立体定位图谱, 参照Earl法［7］在三维推动器的引导下行内侧前脑束(MFB)两点注射6-OHDA (3.6 mg/ml)。坐标如下: (1) TB, －2.3 mm; AP, －4.4 mm; ML, 1.2 mm; V, －7.8 mm; (2) TB: +3.4 mm; AP, －4.0 mm; ML, 0.8 mm; V, －8.0 mm。两点注射6-OHDA的量分别为2.5 和3.0 μl。

2周后, 开始在特制的四道自动旋转仪中测试由阿朴吗啡(apomorphine, APO)诱发的旋转行为。筛选转速＞300 r/h的大鼠作为标准PD大鼠,转速在300 r/h以下者为损毁不成功的PD大鼠(简称非PD大鼠)。

1.2脑铁含量的测定取大鼠双侧纹状体(caudate putamen, CPu)和SN准确称重, 经混合酸溶液消化, 将酸蒸发再用去离子水定容后,在原子吸收分光光度仪上测定样品中总铁的含量, 根据标准曲线得出分析结果。

1.3 黑质内注射FeCl3成年Sprague-Dawley大鼠(200~300g), 8%水合氯醛腹腔注射麻醉。将大鼠头部固定在立体定位仪上,在三维推动器的引导下行SNc内注射FeCl3 。坐标如下: AP, －5.3 mm; L, 1.9 mm; V, －8.2 mm, 注射FeCl3(20 μg/μl)2 μl。

1.4 DA释放量的测定

1.4.1电刺激MFB动物麻醉同前, 将大鼠头部固定在立体定位仪上, 按照坐标［8］: AP, －4.3 mm; ML, 1.5 mm; V, －6.5 mm, 将双极同心圆刺激电极置于MFB区域上方。实验开始后, 每隔10 min将刺激电极下移0.5 mm, 并参照有关资料［8］给予100 Hz、200个脉冲, 1.5 mA、 0.2 ms波宽的负向脉冲方波电刺激, 直至在CPu区记录到DA释放为止。

1.4.2 用快速周期伏安法(FCV)监测CPu区DA的释放［9］按照坐标［8］: AP, +1.1 mm; ML, 2.8 mm; V, －5.5 mm,将碳纤维玻璃微电极插入CPu区, 将刺激电极插入同侧MFB区, 将参考电极置于脑膜表面。实验用Millar伏安分析仪进行CPu区DA释放量的测定。电刺激MFB诱发释放的DA产生的氧化还原波形通过CED1401 plus的特定微机接口输入微机, 通过特定的CED Average软件对波形进行即时的观察、 贮存及联机或脱机分析。DA的氧化电位设定为+600 mV, 在整个实验过程中保持恒定。每次实验结束后, 均用标准DA溶液进行碳纤维微电极的离体校准, 根据各种DA溶液浓度及对应的氧化电流(电压)值,绘出标准曲线, 并根据标准曲线推算出实验测得的各氧化电流(电压)数据对应的DA浓度值, 即可代表电刺激MFB诱发CPu区DA释放的实际释放量［10］(以μmol/L为释放量的单位)。

1.5 CPu内DA及其代谢产物含量的测定大鼠断头取脑, 取出双侧CPu, 应用HPLC法进行CPu内DA及其代谢产物含量的测定。实验用仪器为日本岛津公司6A系列高效液相色谱仪。

1.6组织学检查实验后, 先对刺激电极位置进行定位标记: 固定刺激电极位置, 通以0.2mA的阴极直流电, 通电时间为10 s, 使Fe3+沉积于刺激部位;最后对实验大鼠行心脏灌注, 依次注入0.9% NaCl 10 ml和3%铁氰化钾10 ml+3%亚铁氰化钾10 ml+10%福尔马林5 ml混合液,迅速断头取脑, 置于10%福尔马林液固定5~7 d。取冠状面在冰冻切片机上连续切片至MFB和CPu的相应平面,观察刺激电极及工作电极尖端位置是否准确。位置不准确的资料弃去不用。

1.7 统计学处理实验结果以均数±标准误表示, 采用t检验统计学处理, P＜0.05表明结果有统计学意义。

2结果

2.1 PD模型大鼠SN内铁含量的改变

实验用6-OHDA PD模型大鼠8只, 非PD大鼠6只, 正常大鼠6只, 取其双侧SN, 测定其铁含量。PD模型大鼠损毁侧SN内铁含量为1.09±0.21 μg/mg脑组织湿重,较健侧及正常对照大鼠损毁侧明显升高(P＜0.01); 而非PD大鼠SN内铁含量左右两侧无明显差异,且与正常相比差别无统计学意义(P＞0.05)(**P＜0.01)。

2.2 PD模型大鼠CPu内铁含量的改变

实验分组同前, 取其双侧CPu, 测定其铁含量。PD模型大鼠损毁侧CPu内铁含量为0.17±0.05 μg/mg脑组织湿重,较健侧及正常对照大鼠损毁侧相比差别无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 Desferal对6-OHDA单侧损毁大鼠健侧及损毁侧CPu区DA释放量的影响

实验选用Wistar大鼠共16只, 随机分成对照组(侧脑室注射生理盐水)和实验组(侧脑室注射Desferal, 130 ng)。在侧脑室注射NS或Desferal3 min后, 在MFB处两点注射6-OHDA, 坐标及剂量同6-OHDA PD模型大鼠的制备。4周后分别测试其双侧CPu 由电刺激MFB诱发的DA释放量,对照组损毁侧(A) DA释放量为0.25±0.11 μmol/L, 较健侧(C)明显降低(P＜0.05); 而给予Desferal组损毁侧(B) dA释放量为1.64±0.70 μmol/L, 与对照组损毁侧(A)相比差别有显著性(P＜0.05),而与其健侧(D)相比差别无统计学意义(P＞0.05)。这说明Desferal使损毁侧CPu DA释放量增加(~*P＜0.05)。

2.4 Desferal对6-OHDA单侧损毁大鼠CPu 区DA及其代谢产物含量的影响

在FCV测定结束后, 大鼠断头取脑行HPLC测定, 结果表明Desferal实验组损毁侧CPu区DA含量为1.03±0.18 ng/mg脑组织湿重,较NS对照组损毁侧CPu 区的DA含量高, 差别有显著性(P＜0.01)。DOPAC及HVA的含量也较对照组高, 差异显著(P＜0.01)。而Desferal组健侧DA及其代谢产物的含量与对照组健侧相比,差别无统计学意义(P＞0.05)(**P＜0.01)。

2.5 40 μg FeCl3对大鼠CPu区DA释放量的影响

实验用Sprague Dawley (SD)大鼠9只, SNc内注射FeCl3 40 μg, 3周后由FCV法检测由电刺激MFB诱发的CPu DA释放。损毁侧CPu dA释放量减少至0.13±0.04 μmol/L, 与健侧及正常大鼠相比差异有显著性(P＜0.05)(*P＜0.05)。

2.6 40 μg FeCl3对大鼠CPu区DA及其代谢产物含量的影响

在FCV测定后, 大鼠断头取脑, 取其纹状体进行HPLC测定, 结果显示: 损毁侧CPu DA减少至0.01±0.003 ng/mg脑组织湿重,与健侧相比差异极显著(P＜0.001)(***P＜0.001)。

3讨论

帕金森病是由于SNc DA能神经元的退行性变性导致的疾病。SNc DA能神经元纤维投射到CPu, 其释放的递质是DA, 它对CPu的神经元起两种不同的作用,对基底节直接环路起兴奋作用和对间接环路起去抑制作用, 最终对运动起易化作用。当SNc内DA能神经元损伤后, CPu内DA的释放量减少, 对运动的易化作用减弱,产生以运动不能、 静止性震颤和肌强直为临床表现的帕金森病［11］。

在离体实验中, 已经证明6-OHDA可通过将Fe3+还原为Fe2+, 从而使其从铁蛋白上释放出来［12］, 促进氧化应激反应,还原生成的Fe2+和氧化应激反应生成的OH·可进一步氧化6-OHDA, 通过Fenton反应, 促进生成超氧阴离子(O·〖TX-*8]2, O·〖TX-*8]2)、 h2O2和OH·。 这些反应产物都可以促进铁从铁蛋白中游离出来［13］。6-OHDA同时也是线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅳ的强抑制剂［14］,而这一作用可被铁离子螯合剂Desferal所终止。但是, 在体情况下,6-OHDA是否通过以上机制发挥作用目前仍未见相关的报道。本实验首次在体应用大鼠PD模型研究了铁参与6-OHDA 的神经毒性作用过程的可能性,发现6-OHDA损毁成功的PD模型大鼠中, 由于DA能神经元变性, 使得FCV法监测到的DA释放量明显减低, HPLC测定的DA含量也明显降低, 同时,我们发现这些大鼠的SN内