摘要：采用放射性配基结合法, 测定大鼠全脑缺血后海马细胞膜腺苷(adenosine, ADO)受体数量及亲和力的变化,以探讨其与脑缺血耐受形成之间的关系。发现缺血6 min即可导致海马组织明显的神经元延迟性死亡(delayed neuron death, DND), 缺血3 min不足以引起海马组织明显的DND; 而经过3 min预缺血处理, 可明显减轻间隔1 d后6 min缺血引起的海马DND (P＜0.01)。与此相对应,缺血3 min再灌1和3 d时, ADO受体数量及亲和力明显高于sham组(P＜0.05), 而缺血6 min再灌1和3 d时, aDO受体数量明显低于sham组(P＜0.05), 但亲和力高于sham组(P＜0.05)。与单纯6 min缺血再灌4 h、1和3 d时相比, 3 min预缺血＋6 min缺血(间隔1 d)再灌后, ADO受体数量及亲和力均显著升高(P＜0.05)。这些结果表明,脑预缺血处理可使大鼠海马细胞膜ADO受体数量增多, 亲和力增强, 并能对抗损伤性缺血引起的ADO受体数量减少,提示腺苷受体数量及亲和力的变化在脑缺血耐受形成过程中发挥了重要的作用。轻微、短时、不至于引起神经细胞死亡的脑预缺血处理(cerebral ischemic preconditioning),可对较严重脑缺血引起的神经元损伤产生一定的保护作用, 此现象称为脑缺血耐受(brain ischemic tolerance)［1,2］。Heurteaux采用大鼠全脑缺血模型, 观察到了上述现象, 并提出腺苷(adenosine, aDO)与其受体结合在预缺血保护机制中发挥作用［3］。由于ADO类物质的半衰期很短, 预缺血虽可引起ADO浓度升高, 但不4期 周爱民等:脑预缺血引起大鼠海马细胞膜腺苷受体数量和亲和力升高及其对神经元的保护作用生理学报 Acta Physiol. Sin.53卷轻微、短时、不至于引起神经细胞死亡的脑预缺血处理(cerebral ischemic preconditioning),可对较严重脑缺血引起的神经元损伤产生一定的保护作用, 此现象称为脑缺血耐受(brain ischemic tolerance)［1,2］。Heurteaux采用大鼠全脑缺血模型, 观察到了上述现象, 并提出腺苷(adenosine, aDO)与其受体结合在预缺血保护机制中发挥作用［3］。由于ADO类物质的半衰期很短, 预缺血虽可引起ADO浓度升高, 但不足以维持到其后的损伤性缺血发生。因此,在预缺血保护机制中, ADO受体的变化可能起更重要的作用。为证实这一设想, 本实验在诱导脑缺血耐受的同时,研究脑预缺血后大鼠海马细胞膜ADO受体数量及亲和力的变化, 以探讨两者之间的关系。

1材料和方法

1.1 动物模型与分组采用四血管闭塞(4VO)法制造大鼠全脑缺血模型。健康SD大鼠96只(250～300 g), 雌雄不拘。戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔麻醉后, 颈部背侧纵切口约1.5 cm, 分离椎旁肌暴露第一颈椎横突。在体视显微镜下寻找翼状孔, 插入电烙针凝闭双侧椎动脉, 并在颅骨钻孔,包埋、固定银制电极以供监测脑电。手术完毕供以水、 食, 24 h后在乙醚麻醉下游离双侧颈总动脉, 动物清醒后随机分为4组进行实验。

假手术组(Sham组, n=6): 只暴露双颈总动脉但不阻断血流, 术后饲养3 d 处死取材。

单纯预缺血组(A组): 动物30只, 暴露双颈总动脉但不阻断血流, 间隔1 d后挟闭双颈总动脉致全脑缺血3 min, 然后恢复颈动脉灌流, 分别于再灌注4 h(A1组, n=6)、 1 d (A2组, n=6)、 3 d (A3组, n=6)和7 d (A4组, n=12)处死动物取材。

损伤性缺血组(B组): 动物30只, 暴露双颈总动脉但不阻断血流, 间隔1 d后挟闭双颈总动脉6 min, 然后恢复灌流, 参照A组再灌时间及动物数分为B1、 b2、 B3和B4 4组。

单纯预缺血＋损伤性缺血组(C组): 动物30只, 挟闭双颈总动脉3 min, 间隔1 d后再挟闭6 min, 参照A组再灌时间及动物数分为C1、 C2、 c3和C4 4组。

实验过程中, 用白炽灯照射动物以维持其肛温在37℃左右, 直到恢复活动。4VO前后观察动物脑电及瞳孔变化等, 以判定是否产生脑缺血。

1.2 组织切片及观察方法从A4、 B4、 C4 3组中各随机选取6只大鼠于再灌后7 d断头剥脑, 冠状切取视交叉后1至4 mm脑组织, 用10%福尔马林固定,石蜡切片8 μm, 硫堇染色。参照Kitagawa 和Kato分级方法［1,4］, 观察海马不同区域组织学改变(取双侧平均等级): 0级, 无神经元损伤;1级, 散在的神经元损伤; 2级, 成片的神经元损伤; 3级, 几乎全部的神经元损伤。并在高倍镜下计数海马CA1区每1 mm区段内未损伤的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计数3个区段取平均数为神经元密度(neuronal density)。

1.3 膜受体标本制备及放射性配基结合试验其余大鼠均在预定的时间断头剥脑, 置冰浴中取双侧海马, －80℃保存。实验时分别在40倍体积Tris-HCl (50 mmol/L, pH 7.5, 下同)缓冲液中充分匀浆, 1*#000 g离心10 min, 仔细吸取上清液, 再次离心50*#000 g, 30 min。沉淀以同样液体悬浮, 同样加速度(50*#000 g)离心30 min, 重复2次。将离心所得沉淀以8倍体积0.32 mol/L蔗糖溶液悬浮得到粗制膜,－80℃保存, 全部操作在0～4℃条件下进行。粗制膜使用时于室温下复温, 加适量Tris-HCl缓冲液50*#000 g离心30 min,重复洗涤3次。最后沉淀用1.5 ml同样缓冲液悬浮, 取40 μl 2～4倍稀释,考马氏亮蓝G250法测定蛋白含量(试剂盒由南京建成提供)。将膜受体标本蛋白含量调至1 mg/ml备用。

将［8-3H］腺苷(3H-ADO)原液(中国原子能科学院同位素研究所提供)用Tris-HCl缓冲液配制成0.8 μmol/L工作液。每200 μl膜受体标本(蛋白终浓度fc=0.5 mg/ml), 分别与5～150 μl ~3H-ADO工作液(终浓度fc=10～300 nmol/L), 在Tris-HCl缓冲液中于室温孵育120 min(总反应体积为0.4 ml), 使反应达到平衡后, 加入3 ml冰冷的缓冲液终止反应。以125 μmol/L的非标记ADO(Sigma公司产品)所抑制的结合配体为非特异性结合。反应物经双层虹光69型玻璃纤维滤纸以恒定负压抽滤, 滤膜用3 ml冰冷缓冲液迅速淋洗4次,干燥后用Beckman LS6500液体闪烁仪测定滤膜上的放射强度, 特异性结合量等于总结合量减去非特异性结合量。

1.4 数据处理及统计学检验放射性配基结合试验测得数据, 通过Microsoft excel程序处理得到Scatchard和Hill作图数据, 经直线回归,求得各标本受体的最大结合位点数Bmax和平衡解离常数Kd, 分别用于反映ADO受体的数量及亲和力。组织学分级、 神经元密度及各组Bmax、 Kd值均以mean±SD表示,并采用ANOVA及q检验进行统计学分析。

2结果

4VO过程中, 随着闭塞血管时间的延长, 观察到大鼠瞳孔散大, 翻正反射消失, 脑电波频率变慢, 波幅逐渐缩小甚至呈等电位线, 说明产生全脑缺血。再灌注后,脑电异常仍持续一定的时间, 大约2～4 h基本恢复正常; 除开始几小时自主活动增多外, 所有动物均未发现明显的神经功能异常。

2．1 脑缺血后大鼠海马组织学改变

a4组大鼠海马组织无明显损伤, 锥体细胞排列整齐致密, 形态完整, 胞核饱满, 核仁清晰, 尼氏小体丰富。B4组海马组织有明显损伤, 主要表现在CA1、 cA2区大量锥体细胞缺失, 残留的锥体细胞排列松散不规则, 多数细胞胞核固缩, 核仁欠清晰, 尼氏小体减少或消失。C4组海马锥体细胞排列比较整齐致密,胞核饱满, 核仁较清晰, 仅有少量散在的CA1区锥体细胞缺失或胞核固缩。B4组海马组织学改变与A4、 C4组有显著性差异(P＜0.01),主要表现在CA1和CA2区锥体细胞的损伤, A4与C4组无明显差异。结果表明, 经3 min预缺血处理, 可对1 d后的6 min缺血引起的海马神经元延迟性死亡 (delayed neuron death, DND)产生保护作用。

2．2 脑缺血后大鼠海马细胞膜腺苷受体的变化

2.2.1 Bmax变化单纯预缺血组中, A2和A3组Bmax值明显高于Sham组(P＜0.01, P＜0.05); 而在损伤性缺血组中, b2和B3组则明显低于Sham组(P＜0.05, P＜0.01)。单纯预缺血+损伤性缺血组中, C1组Bmax值明显高于Sham组(P＜0.01), C2、 c3、 C4组与Sham组无明显差异(P＞0.05), 但C1、 C2、 C3组分别明显高于B1、 B2、 B3组(P＜0.01)。结果表明,单纯预缺血可使大鼠海马细胞膜ADO受体数量增加, 而损伤性缺血则使受体数量减少, 均以再灌后1和3 d表现较为突出; 而且, 经过预缺血处理,可以对抗损伤性缺血导致的ADO受体数量减少。

2.2.2 Kd变化在单纯预缺血组中的A2、 A3和A4组, Kd值明显低于(即亲和力强于)Sham组(P＜0.01, P＜0.05)。在损伤性缺血组中的B2、 b3组, Kd值也明显低于Sham组(P＜0.05), 但分别高于(即亲和力弱于)A2、 A3组(P＜0.05)。在单纯预缺血+损伤性缺血组中的C1、 C2、 c3和C4各组, Kd值均显著低于Sham组(P＜0.01, P＜0.05); 与损伤性缺血组相比, C1和C2、 C3组还分别明显低于B1和B2、 b3组(P＜0.01, P＜0.05)。结果表明, 单纯预缺血可使海马细胞膜ADO受体的亲和力增强, 以再灌后1、 3和7 d表现较为突出;损伤性缺血虽然也可使ADO受体亲和力增强, 但不如单纯预缺血组增强趋势明显; 而且, 经过预缺血处理可使损伤性缺血后ADO受体的亲和力进一步增强。

3讨论

海马组织对缺血性损伤最为敏感, 尤其是CA1区锥体神经元。本实验观察到, 大鼠全脑缺血6 min即可导致海马CA1、 CA2区锥体神经元明显的DND;单纯预缺血3 min不足以引起海马组织损伤; 而且3 min预缺血处理可以诱导海马组织产生缺血耐受, 对间隔1 d后6 min缺血引起的CA1、 cA2区锥体神经元DND产生明显的保护作用。该实验结果, 与国外学者［3］报道基本一致。适当的预缺血处理可以增强神经元对损伤性缺血的耐受性已被公认,但其具体的神经保护机制, 目前认识不甚清楚。许多学者认为可能与c-fos、 c-jun等基因表达上调和HSP蛋白合成增加有关［5～8］,脑缺血耐受诱导所需时间(多在24 h以上)和耐受持续时间(5～7 d)均较长<