摘要：实验运用微电极穿刺技术, 初步探索了刺激鲫鱼右侧迷走神经在双侧Mauthner (M)细胞胞体诱发的胞内电位变化。结果表明: (1)直接刺激鲫鱼右侧迷走神经, 可在同侧或对侧M细胞胞体记录到一种短潜伏期、长持续时间、分级的、复合的突触后电位(postsynaptic potentials, pSPs)。此PSPs表现出明显的强度依从性和频率依赖性。(2) 刺激迷走神经诱发的PSPs可使逆向锋电位的幅度降低。(3) 肌注士的宁后, PSPs的幅度增高、平均持续时间增加、峰值前移,并且可爆发两个以上的动作电位。上述结果提示: 迷走神经到M细胞的通路可能是由长短不等的神经链群组成的, 且此通路中不仅包含有兴奋性成分还包含有抑制性成分,而兴奋和抑制之间的相互关系可能起着调节M细胞兴奋性的作用。细胞(M细胞)是硬骨鱼和某些两栖类动物延髓中的一对特殊神经元, 它接受外周和中枢的多种输入信息, 经过分析和加工这些信息发动或抑制逃跑反射。由于其特异的形态学和电生理学特性［1］, 自20世纪60年代以来, m细胞一直是研究中枢神经系统功能的较好模型。在神经通路、突触性质、突触分布、神经递质和中枢整合等神经学研究中,M细胞发挥了其它动物的神经细胞难以替代的作用,因此甚至被喻为“微型中枢神经系统”［2］。

本实验旨在通过刺激鲫鱼迷走神经, 观察起源于其感觉纤维的信息对M细胞胞内电位变化的影响。以往的研究表明, 投射到M细胞的输入信息既有兴奋性的又有抑制性的,既涉及化学突触又与电突触有关。 而其兴奋性感觉输入一般可分为两类: 一类信号强大, 在没有其它兴奋性输入的帮助下即能激活M细胞,发动逃跑反射,听觉和视觉输入即属于此类［3,4］; 另一类来自前庭、 侧线、 躯体及嗅神经的感觉性输入［5～8］, 只引起较弱的、 持续时间较长的EPSP,不能激活M细胞只起到修饰M细胞兴奋性的作用。迷走神经是一混合神经, 兼有感觉和运动功能, 感觉纤维由与其有关的器官, 如心脏、 咽喉、 腮、 肠等处,作向心的延展, 经过迷走神经到达脑部［9］。因此通过研究迷走神经感觉纤维所引起的M细胞电生理学的变化,可以初步了解起源于内脏的感觉输入对M细胞电生理活动的影响。

1材料和方法

1.1 实验动物的准备国产鲫鱼, 体长10～15 cm, 置于0.5%的乌拉坦溶液中, 使其自由游动。 约10 min后当鱼体翻倒而鳃盖仍保持节律性呼吸动作时取出, 以头朝前、 背朝上的方位夹持在特制鱼槽中,用循环泵将含0.5%的乌拉坦溶液的自来水经口持续灌注鳃部以维持呼吸。

在躯干右侧, 于背鳍尾缘下方4 mm处向尾侧做1 cm×1.5 cm的矩形切口, 清除皮肤及肌肉组织, 暴露其下方的椎骨。打开颅腔,用电动吸引器吸净组织液及脑膜组织, 暴露视叶、 小脑及迷叶, 将小脑翻向头端, 暴露延髓, 以备安放记录电极。将右侧迷叶向左推移,暴露同侧迷走神经。肌肉注射三碘季铵酚(1～3 μg/g)以制动, 并将鱼体用湿纸巾包裹, 以防其干燥。为防止打开颅腔后一段时间内,由于颅腔内液体蒸发和脑表面下陷造成实验误差, 手术完成后30 min才开始进行下面的实验。全部实验都在室温(18～25℃)条件下进行。

1.2刺激与记录在椎骨及迷走神经表面分别安放双极刺激电极, 并在右侧迷叶与颅骨之间的腔隙内灌注液体石蜡,覆盖迷走神经。将参考电极置于脊柱头端椎旁肌肉处,用间隔700 ms、 波宽30 μs的方波脉冲刺激脊髓, 使M细胞逆向激活, 根据M细胞所特有的胞外逆向锋电位的幅度,估计记录电极对M细胞胞体的相对位置［1］, 最终将记录电极定位于轴突帽负电中心处, 然后将微电极向外侧移动50 μm刺入M细胞胞体, 并依次进行下面的实验:(1) 停止刺激脊髓, 改用同样刺激间隔、 同样波宽的单个方波脉冲刺激迷走神经, 记录M细胞胞体内电位变化。(2)将刺激电极移至迷走神经稍外的颅骨上或迷走神经稍外的其它部位, 以同样刺激参数的单个方波脉冲刺激迷走神经, 记录M细胞胞体内电位变化。(3)以迷走神经刺激作为条件刺激, 脊髓刺激作为测试刺激, 每次扫描时改变两个刺激之间的时间间隔, 记录M细胞内电位变化。(4) 停止刺激脊髓及迷走神经,肌肉注射硝酸士的宁(5 μg/g), 然后恢复刺激迷走神经, 记录M细胞内电位变化。

实验中, 使用尖端直径为1 μm的玻璃微电极穿刺M细胞, 用0.6 mol/L K2SO4溶液灌注, 电极电阻为4～10 MΩ。

实验结果由计算机实时处理系统储存和分析。

2结果

刺激一侧迷走神经可在同侧或对侧M细胞胞体记录到一种短潜伏期、长持续时间、 分级的、 复合的突触后电位(postsynaptic potentials, PSPs),其反应特性如下:

2.1 强度依从性

以一定强度刺激鲫鱼一侧迷走神经, 可在同侧和对侧M细胞胞体记录到一种复合的PSPs 。 刺激之后首先出现的短暂去极化波为α成分, 其潜伏期约为0.60 ms,持续时间短(约为0.70 ms), 轮廓光滑。在以8 V强度刺激时幅度为1.88 mV ; 当刺激强度逐渐增大时, 其潜伏期无明显改变, 但幅度增大; 以15 v强度刺激时达到4.92 mV , 且形状变得尖耸。在所做的40例实验中, α成分的最高幅度可达15 mV。α成分之后的去极化波被总称为β成分, 持续时间较长,以8 V强度刺激时幅度为0.49 mV(由基线到β成分最高峰的高度)。 随着刺激强度的增加, 幅度逐渐增高。 以15 V刺激时幅度达到5.06 mV。

并且其上重迭的波峰数目增多, 反应持续时间延长(可达3 ms以上)。由于β成分的起始点常常与α成分的后部重迭, 不易准确测量其潜伏期,而峰值潜伏期往往随着刺激强度的变化而变化。当刺激强度足够大时(本实验中为30 V), M细胞可被激活,动作电位可在任一成分的基础上发生。

在所做的40例实验中, α成分的潜伏期在0.54～0.73 ms之间, 平均值为0.62±0.07 ms, 而β成分的峰值潜伏期在2.36～3.74 ms之间,平均值为3.25±0.12 ms。

刺激一侧迷走神经在同侧或对侧M细胞胞体记录到的反应的潜伏期和其它基本特征无明显差别。对迷走神经稍外的部位施加刺激, 不能引起M细胞产生反应。

2.2 频率依从性

刺激迷走神经诱发的M细胞PSPs的两种成分在刺激频率-幅度关系上表现出明显的频率依从特性: 在同样刺激强度下,刺激频率增高将使反应幅度显著衰减。为刺激右侧迷走神经在左侧M细胞胞体记录到的反应, 刺激强度为15 V, 当后续刺激的时间间隔由30 s依次缩短为1 s、500 ms和 50 ms时, α成分的幅度由稳态30 s时的最大幅度5.90 mV分别降低到5.62、 4.88和2.24 mV,而β成分的幅度则由稳态时的7.28 mV分别降低到5.17、 4.02和3.12 mV, 表现出了突触传递易疲劳的特性。

本工作在所穿刺的20例细胞中进行了频率依从性研究, 均表现出相同的特性; 刺激一侧迷走神经在双侧M细胞亦表现出相同的规律性。

2.3 迷走神经诱发的PSPs引起逆向锋电位幅度改变

在在每次扫描时给予一对刺激, 第一个为条件刺激, 作用于迷走神经; 第二个为测试刺激, 作用于脊髓。给予脊髓的刺激强度刚刚超过阈值；而给予迷走神经的刺激强度则为20 v, 低于顺向激活M细胞所需的阈值。每次扫描时两个刺激之间的时间间隔不同。结果发现: 刺激迷走神经所产生的PSPs使逆向锋电位的幅度在3 ms处开始出现降低,最大降低发生于刺激迷走神经后6～7 ms, 降低的幅度约为30%, 在15 ms后恢复到原水平。

在所穿刺的8例M细胞中, 逆向锋电位幅度均表现出相同的变化趋势, 而且刺激一侧迷走神经在双侧M细胞所记录到的反应无明显差异。

2.4 肌注士的宁对M细胞胞内反应的影响

肌注士的宁后5 min PSPs的幅度开始升高, 20 min后达到最大值。在整个记录过程中(从注射士的宁到实验结束为90 min)未见衰减。为士的宁注射前、后30 min以不同强度刺激迷走神经在M细胞胞体记录到的反应。由图可见, EPSP变得很明显, 在士的宁注射之前, 以10 V强度刺激迷走神经PSP的幅度只有3 mV (由基线到PSP最高峰的高度), 而注射士的宁之后, PSP的幅度可达10 mV以上, 有时甚至可以爆发动作电位。在所做的10例实验中, 平均的PSP幅度由3.95 mV升高到14.85 mV。如果在士的宁注射之前, 以30 V强度刺激迷走神经激活M细胞, 注射士的宁后30 min以同样强度刺激迷走神经,会发现在原来的动作电位之后又爆发了两个动作电位。在刺激强度逐渐增加的过程中,刺激迷走神经在M细胞胞体记录到的反应, 随着刺激强度的加大,爆发的动作电位数目逐渐增多, 且PSPs的平均持续时间增加、 峰值前移。

3讨论

迄今为止尚未见到有关M细胞和迷走神经联系的其它文献, 本实验运用微电极穿刺技术初步探索了刺激鲫鱼右侧迷走神经在双侧M细胞胞体诱发的细胞内电位变化, 结果发现:

3.1 迷走神经至M细胞生理学通路较为复杂

根据α成分潜伏期较短及β成分潜伏期较长、 持续时间长和有多个峰波重迭在去极化波上的特点等特性来推测, 这一通路可能是由长短不等的神经链群组成的。最短的神经链群可能只经过一次突触接替, 它们参与α成分的形成; 经过多次突触接替后到达M细胞的长链通路则与β成分的形成有关,而β成分的形成也可能是由虽经一次突触接替, 但传导速度较慢的纤维形成的。此外, 在形成α及β成分的神经链群中的某一环节,也可能存在电突触。在实验中所观察到的α及β成分的幅度随着刺激强度的增加而增加, 这可能是由于随着刺激强度的增加,输入通路上受到刺激而产生反应的神经纤维越来越多之故。