摘要：选择健康SD雄性成年大鼠60只, 随机分成对照组(C组)、镉负荷中剂量组（M组）和镉负荷高剂量组（H组）, 每天分别饲喂含镉0、 5、 10 mg/kg的大鼠全价饲料, 连续6周, 研究了镉负荷对大鼠睾丸及生殖内分泌功能活动的影响。结果显示: 在整个实验期内, m和H组大鼠睾丸组织中的镉含量极明显上升, 锌含量稍有下降, 与对照组差异不显著; 血浆镉、 锌含量虽分别表现稍有升高和下降, 但与对照组比较无明显差异; h组睾丸精子头计数和每日精子生成量在镉负荷第3周极显著下降, 第6周时, M和H组均极明显低于对照组; 在整个实验期内, H组大鼠ALP活性明显低于C组; lDH-X活性在M和H组大鼠均极明显低于C组; M和H组血浆T水平下降, 均低于或显著低于C组; 3组间的FSH和LH水平无明显差异。结果提示:慢性镉负荷在睾丸组织中逐步蓄积可引起睾丸一些酶活性改变、精子生成减少及内分泌功能活动低下。镉是一种重要的工业和环境污染因素, 被美国毒理管理委员会(ATSDR)列为第六位危及人体健康的有毒物质。生活环境中的镉一般以难溶的氧化镉烟尘的形式存在,由于不能生物降解, 易在体内蓄积。镉被吸收入血液后, 可迅速与血浆白蛋白等成分结合, 并随血流分布到各器官,对人和动物的多种器官组织和细胞具有毒性［1］。关于镉的生殖毒性作用国内外已有许多研究报道。有资料显示, 镉可以诱导睾丸、附睾和精囊腺等组织器官发生结构和功能上的退行性变化, 引起生精障碍, 甚至不育［2~8］。一些研究资料认为,镉对睾丸中一些酶活性的影响可能是其生殖毒性发生的重要机制［9,10］。这些研究中多采用经腹腔注射或皮下注射等急性染毒途径,而对镉经口慢性染毒所产生的生殖毒性作用的报道较少。本研究采用经食物慢性镉染毒, 系统研究了不同剂量氯化镉引起的镉负荷大鼠的血液和睾丸中镉和锌含量、睾丸每日精子生成量、睾丸碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)和乳酸脱氢酶同工酶-X (lactate dehydrogenase-X, lDH-X)活性、以及生殖内分泌激素水平的变化, 旨在揭示镉对雄性生殖及其内分泌功能活动产生的影响,为进一步研究慢性镉负荷对人类雄性生殖毒性作用及其机制提供科学依据。

1材料和方法

1.1 实验动物 选用的60只健康SD雄性成年大鼠 (253±5 g)由南京江浦动物饲养场提供。经3 d的适应性饲养后, 随机分成3组, 即对照组 (C组)、镉负荷中剂量组 (M组)、 镉负荷高剂量组 (H组), 每组20只。每天分别给C组、 M组、 H组饲喂含镉0、 5、 10 mg/kg的大鼠全价饲料,进行慢性镉负荷实验, 共喂服6周。大鼠均自由采食、 饮水。 饲养过程中, 每天换水, 隔日换1次笼中的木屑垫料以保持清洁。环境温度20～25℃。

1.2 样品采样和处理 在镉负荷后的第3、 6周, 分别给每组大鼠称重，并取8只摘眼球采血样5 ml, 迅速放入含有肝素钠(1∶500)的试管中即刻混匀,然后将血液置于4℃离心(3000 r/min, 20 min), 取出血浆置于－20℃保存以便用于指标测定。

宰杀大鼠, 剖检、 观察病变, 并取睾丸组织, 放入生理盐水中冲洗, 吸干, 剥离被膜, 称取1 g睾丸实质， 适当剪成小碎块, 加生理盐水4 ml,在4℃条件下制成匀浆液, 4℃离心 (4000 r/min, 30 min), 取出上清液置于－20℃保存待测。其中用于分析LDH-X的上清液须置于65℃水浴中加热30 min, 以破坏除LDH-X以外的其它酶的活性［11］。将余下的睾丸实质取一半剪碎、称重, 加20 ml SMT溶液, 高速匀浆2 min,制成睾丸组织匀浆液。

1.3 测定指标和方法 血浆和睾丸组织中镉和锌含量测定采用AA-6501F型原子吸收分光光度仪分析; 睾丸组织蛋白质含量、 ALP和LDH-X活性用比色法,试剂盒由南京建成工程研究所提供; 血浆睾酮 (testosterone, T)、 促卵泡刺激素 (follicle stimulating hormone, fSH)、 促黄体刺激素 (luteinizing hormone, LH)水平用放射免疫分析法, 试剂盒由北京北方生物技术研究所提供;睾丸每日精子生成量的测定: 充分混匀睾丸组织匀浆液, 吸取10 μl放入血球计数板, 静置5 min后在相差显微镜下进行精子头记数, 记数方法同血细胞计数,每个样本计数2块板共4个计数室, 取平均值。计算每日精子生成量表达式为: P=h×5×104×20÷g÷6.1 (P: 每日精子生成量; h:4个记数池精子头记数的平均值; g: 实际匀浆睾丸重量)［2］。

1.4 数据处理 以mean±SEM表示, 用Statistica软件对数据作Students′ t检验, 确定差异显著性。

2结果

2.1 镉负荷大鼠血浆和睾丸组织中镉、 锌含量变化

由表1可见, M和H组大鼠睾丸组织中的镉含量极明显上升, 第3周分别比对照组高3.8和7.4倍, 第6周分别高于对照组13和25倍; 锌含量稍有下降,但与对照组差异不明显。镉负荷大鼠血浆镉、 锌含量在整个实验期虽分别表现稍有升高和下降, 但与对照组差异不显著。

2.2 镉负荷对大鼠睾丸每日精子生成量的影响

睾丸每日精子生成量在镉负荷第3周时M组与对照组无显著差异, 而H组极显著低于对照组; 在第6周时, m和H组均极明显低于对照组。表明镉对大鼠精子生成过程的影响程度与染毒剂量和时间密切相关。

2.3 镉负荷对大鼠睾丸组织匀浆液中ALP和LDH-X活性的影响

在整个实验期内, 镉负荷H组大鼠ALP活性明显低于对照组, M组与对照组没有显著差异; LDH-X活性在M和H组大鼠均表现下降, 与对照组比较差异显著。

2.4 镉负荷对大鼠血浆T、 FSH和LH水平的影响

在整个实验期里, M和H组血浆T水平下降, 均低于或显著低于C组; 3组间的FSH和LH水平无明显差异 。

3讨论

本研究显示, 镉负荷M和H组大鼠睾丸组织中的镉含量极明显上升, 第3周分别比对照组高3.8和7.4倍, 第6周分别高于对照组13和25倍,说明睾丸对镉的毒性反应敏感, 是镉作用的靶器官之一。慢性镉负荷过程中, 大量的镉富集于睾丸等靶器官, 这可能是使大鼠血浆镉含量与对照组相比未表现明显升高的原因。

本研究结果表明, 慢性镉负荷大鼠各组间体重无明显差异, 无明显临床症状, 剖检也未发现异常。在镉负荷后的第3和6周, M和H组大鼠睾丸重、睾丸脏器系数与对照组相比差异均不显著, 但发现睾丸每日精子生成量下降, 且其降低的程度随时间延长而加重。提示镉会阻止精子的形成,致使动物生育障碍。许多研究资料已表明, 镉可以直接诱导睾丸、 附睾和精囊腺等组织器官发生结构和功能上的退行性变化［2-8］。镉对睾丸和附睾的影响,早期表现为血管的改变, 而晚期主要危害睾丸的实质细胞［12］。即睾丸毛细血管通透性增高, 血流量减少, 血流缓慢, 继发睾丸组织水肿、 缺血和坏死［13］;生殖上皮细胞可见广泛变性、 坏死、 核皱缩, 曲细精管纤维化, 直至睾丸萎缩、重量减轻、 硬化［12］;附睾仅见附睾头部有短暂少量的血液供应减少和毛细血管通透性增加, 而体部和尾部无明显变化, 附睾组织对镉的毒性作用反应也较睾丸轻, 表现为附睾上皮变性、萎缩、体积缩小, 管间结缔组织增生。支持细胞对各级生精细胞起支持作用, 镉降低支持细胞的存活率, 导致细胞不可逆地损伤和坏死, 因而影响生精细胞的发育和分化,最终表现生精细胞脱落坏死。结合分析本研究结果, 可以认为, 经食物慢性负荷镉对雄性生殖的毒性, 一方面与负荷的剂量直接相关;另一方面与镉负荷后在不同时间内对精子生成过程的不同环节造成的影响有关。

本实验未见各组间睾丸组织和血浆锌含量有明显差异性变化, 但睾丸ALP一种含锌酶的活性在H组明显下降,显示高镉负荷影响ALP活性。由于镉与锌在元素周期表中同属于IIB族, 它们与机体某些部位结合时呈竞争性作用［14］, 同时由于镉与蛋白质巯基的结合比锌稳定,故镉能将含锌酶ALP中的锌不可逆地置换出来, 导致ALP活性下降。ALP活性下降势必干扰或限制各级生精细胞的营养和能量供应, 因为ALP主要存在于精原细胞、早期发育阶段的初级精母细胞及各级生精细胞与支持细胞的交界面上, 与睾丸生精细胞的分裂活动密切相关,并参与营养物质向各级生精细胞的转运［1,15］。本研究M组睾丸ALP与对照组相比未见有显著差异, 提示ALP作为反映中、小剂量镉慢性负荷所引发的生精障碍的标志酶不可靠, 尚需进一步实验论证。

lDH-X不以锌离子为辅助因子, 是一种从初级精母细胞开始出现的特异性酶, 主要存在于粗线期精母细胞以后的生精细胞的线粒体中,与生精细胞糖的酵解活性密切相关［9］。有人研究亚急性镉中毒发现睾丸LDH-X活性显著下降,表明LDH-X活性变化是睾丸镉中毒的灵敏指标［15］。本研究采用慢性镉负荷的方法亦进一步证实了这一点。综合以往的研究,分析认为镉对LDH-X活性的影响是对生精细胞线粒体的作用引起的, 镉诱发线粒体膜脂质过氧化, 使细胞和线粒体膜的完整性受到破坏,从而造成睾丸组织中的LDH-X活性降低。

本研究发现, 慢性镉负荷大鼠血浆FSH和LH水平没有显著变化, 但T水平在第3和6周均低于或显著低于对照组,分析认为是由于镉对睾丸的直接损伤影响其内分泌机能造成的。有研究表明, 镉对睾丸间质细胞有早期直接损伤作用［5］;光镜下观察到镉染毒大鼠睾丸组织可见其间质组织中有大量红细胞, 细胞明显变性坏死, 曲精小管中, 精原细胞、 次级精母细胞呈空泡状变性坏死,严重时大量脱落［6］, 说明镉对睾丸毒性很强。徐晨等的研究表明， 小剂量镉可使大鼠血清T水平迅速下降, 至第7天达最低值［7］。体外实验也提示,镉对睾丸间质细胞雄激素的合成与分泌功能有损伤作用［8］。由此, 可以清楚地认为, 血浆T水平下降是镉通过对睾丸间质细胞直接损伤作用的结果,显示出睾丸内分泌机能