摘要：为探讨癫痫源性脑损伤形成早期不同脑区病理改变和行为发作的动态发展特征, 本研究对大鼠右背侧海马(hippocampus, HPC)施加慢性强直电刺激(60 hz, 2 s, 0.4~0.6 mA)诱发癫痫发作, １次/d。每天记录大鼠原发性湿狗样抖动(wet dog shakes, WEDS)频率,分别对大鼠施加电刺激2、 4、 6、 8和10 d后进行核磁共振成像(T2 weighted magnetic resonance image, t2-WI)检测, 并对鼠脑进行了组织学切片鉴定。结果表明：与空白对照组相比较, (1) 施加2 d强直电刺激时, 大鼠双侧背部侧脑室(lateral ventricle, LV)区域呈现对称性T2-WI信号绝对值增加(n=4, 左侧P=0.0018; 右侧P=0.0010); 施加6 d强直电刺激时,大鼠呈现植入电极对侧中、腹部LV区域T2-WI信号值增加 (n=5, P=0.0073; P=0.0249); 施加8 d强直电刺激后,大鼠仅出现植入电极对侧腹部LV区域T2-WI信号值增加(n=3, P=0.0340); 施加10 d强直电刺激后, 大鼠植入电极同侧腹部LV区域T2-WI信号值增加(n=4, p=0.0107); (2)随着强直电刺激天数增加, 大鼠原发性WEDS频率高峰期出现在第4个刺激日, 然后WEDS频率下降,与T2-WI信号强度增加之间呈高度负相关关系(相关系数r=-0.987, P＜0.02); (3)组织学切片鉴定： T2-WI检测LV信号异常区域与组织学切片观察LV扩大相吻合,同时发现LV脉络膜丛上皮细胞病理性增生。以上观察结果证实： 慢性强直电刺激大鼠CA1基树突区诱发大鼠癫痫点燃现象形成之前, LV区域T2-WI信号增强具有背、腹方向以及跨半球动态扩布特征。预示了颞叶癫痫早期脑损伤形成中病理性神经网络的重建现象,其机制有待进一步探讨。癫痫的形成过程也是中枢神经系统神经网络重建的过程［1,2］, 这些重构的病理性神经网络的异常活动特征是理解颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)发生机制的关键。在实验性TLE研究中, 将荷包牡丹碱注入幼年猴的内嗅皮质(entorhinal cortex, EC),可以引起海马(hippocampus, HPC)区域核磁共振(magnetic resonance image, MRI)检测信号增强, 组织学切片证实了HPC神经元丢失和神经胶质细胞硬化［3］。而TLE患者可以出现癫痫灶同侧HPC硬化,甚至累及对侧, 引起中等程度的神经元丢失［4］。我室近期实验研究证实: 慢性强直电刺激右背侧HPC或中部颞叶新皮质(medial temporal lobe neocortex, MTNC)可以在大鼠癫痫点燃现象出现之前, 引起MRI检测双侧侧脑室(lateral ventricle, LV)信号增强。组织学切片研究证实这些MRI信号增强与LV扩大及脑室脉络膜丛上皮细胞病理性增生有关［5~7］。以上研究表明: MRI检测的致痫灶以外的脑区信号异常具有明显的神经网络特征,甚至累及对侧大脑半球, 与人类TLE的跨半球扩布特征吻合。但是, 这些病理性神经网络的动态发展特征与TLE发生之间的关系仍然不十分清楚。本研究采用慢性强直电刺激右背侧海马CA1基树突区方法,分别在给予刺激的第2、 4、 6、 8和10 d观察大鼠脑部MRI的变化, 同时检测脑组织切片、 HPC电图、 原发性湿狗样抖动(wet dog shakes, wEDS)频率, 探讨在大鼠癫痫点燃现象出现之前的早期癫痫源性脑损伤的神经网络动态发展特征, 以期进一步揭示TLE发生的神经网络机制。

1材料和方法

1．1 慢性大鼠癫痫模型制作 雄性Sprague-Dawly大鼠28只(20~25 d), 体重40~50 g。在0.4%戊巴比妥钠 (40 mg/kg)腹腔麻醉下将动物头部固定在脑立体定位仪(江湾Ⅰ型C, 上海)上, 行开颅术。按照《大鼠脑立体定位图谱》［8］,将不锈钢双极同芯电极(尖端直径约0.1 mm)植入大鼠右背侧海马CA1基树突区(P: -2.0 mm, R: －2.0 mm, H: －2.0 mm; n=19)。颅骨表面用牙托粉固定电极, 经生理八道仪(RM-6008, Nihon Kohden)记录动物首次深部电图。动物苏醒后,在标准实验室条件下喂养。采用刺激器(SEN-7203, Nihon Kohden)经刺激隔离器(SS120J, Nihon Kohden)对实验组大鼠施加强直电刺激(60 hz, 0.4~0.6 mA, 2 s), 刺激强度调节到诱发大鼠出现原发性WEDS的最小强度。 1次/d, 连续刺激2 d (n=4)、 4 d (n=3)、6 d (n=5)、 8 d (n=3)和10 d (n=4)后, 进行MRI检测和末次深部电图记录。

有关慢性TLE大鼠行为发作的记录方法请参考文献［5］。

关于假电极对照组(仅埋藏电极, 不施加刺激)、 空白对照组和实验组MRI绝对值之间的比较详见前文［5,7］。

1．2 核磁共振成像 分别在施加强直电刺激后的第2、 4、 6、 8、 10天对大鼠进行MRI检测(Bruker Biospec 47/30, 德国),磁场强度为4.7 T, 质子共振频率为200 MHz。对大鼠进行10%氨基甲酸乙酯(1 g/kg)腹腔麻醉, 体温维持在37℃左右。采用常规的自旋回波脉冲序列,轴位切片, 连续8片, 片厚0.75 mm, 片间距1 mm, 成像面积为30 mm×30 mm, 每片像距阵大小为128×128。T2-WI采样参数为: TR=2500 ms, TE=30 ms, 回波数为16, NA=3, 成像时间为34 min 6 s,利用单指数拟合得到T2像或读取选定脑区的T2数值。为了观察人工致痫灶以外脑区MRI异常信号的变化, 对4片含有HPC的连续MRI切片进行视觉分析后,选择变化明显的两片MRI切片进行信号绝对值的测量与分析。根据相对于前囟中心的距离分别称为前片(anterior MRI slice , AMS)和后片(posterior mRI slice, PMS)。AMS含有明显的电极痕迹, 可见背侧HPC和LV下角的头、 尾部(相当于前囟后1.6~2.5 mm); pMS不含有电极植入痕迹, 可见腹、 背侧HPC和LV下角的中部(相当于前囟后2.6~3.5 mm)。

根据MRI信号强度变化所处的脑区位置, 分别在LV下角头部或背侧HPC(背部)、 海马伞或LV下角中部(中部)以及LV下角尾部或腹HPC(腹部)处,读取像元大小为2×2区域(0.22 mm2)内的T2值(ms), 进行双侧大脑半球对称性的分析。

1．3 组织学鉴定 实验结束后, 用0.9%氯化钠100 ml和0.1 mol/l磷酸缓冲液配制的4%多聚甲醛200 ml对动物进行心脏灌流, 取脑固定,将脑置于4℃冰箱保存24 h。对脑组织进行取材、 石蜡包埋、组织学切片(片厚6 μm)和 HE(苏木素-伊红)染色, 光镜下鉴定电极尖端位置和脑组织结构的变化,并与MRI检测结果进行比较。

2结果

经组织学切片证实后, 对电极尖端位于CA1基树突区的实验组大鼠的行为学、 脑电图和MRI检测资料进行统计学分析, 发现59%的实验组大鼠末次HPC电图出现癫痫点燃样电活动。

2．1 MRI检测信号异常

本工作首先对2、 4、 6、 8和10 d刺激组大鼠AMS和PMS的背、 中、 腹部T2-WI信号强度进行视觉分析, 然后读取信号绝对值定量分析,以研究T2-WI异常信号强度在颞叶癫痫早期脑损伤形成过程中的动态区域分布特征。

2.1.1 视觉分析 实验组大鼠LV区域T2-WI信号增强呈现以下特征: 如图3A所示, (1)强直电刺激2 (n=4)及4 d大鼠(n=3)AMS均呈现双侧对称性信号增强, PMS呈现植入电极对侧为主的非对称性信号增强; (2)强直电刺激6 d大鼠(n=5)AMS和PMS均表现以植入电极对侧为主的非对称性信号增强; (3)强直电刺激8 d大鼠(n=3)AMS和PMS呈现植入电极同侧略重的非对称性信号增强; (4)强直电刺激10 d大鼠(n=4)AMS和PMS呈现植入电极同侧为主的非对称性信号增强程度加重。

结果发现: 强直电刺激右背侧海马CA1基树突区引起大鼠LV区域T2-WI信号异常的跨半球动态扩布特征, 是异常信号最早出现在双侧背部(刺激2 d),然后扩布到双侧腹部(刺激4 d)以及植入电极对侧背、 中、 腹部(刺激6 d), 最终扩布到植入电极同侧腹部(刺激10 d)。全部8片MRI切片中仅AMS以及PMS片出现T2-WI信号异常, 说明强直电刺激右背侧海马CA1基树突引起的LV区域信号异常仅仅扩布到距离植入电极处向后1 mm左右。

2.1.2 定量分析 读取2、 4、 6、 8和10 d刺激组大鼠AMS和PMS双侧背、中、 腹部T2值(ms)进行t检验分析发现, 统计学上有显著差异的某些LV区域T2-WI信号异常的分布与视觉分析获得的观察结果基本吻合:(1)电刺激2 d大鼠AMS呈双侧背部对称性T2值显著增加(左侧P=0.0018; 右侧P=0.0010); (2)电刺激6 d大鼠PMS发展为植入电极对侧中部、 腹部T2值显著增加(P=0.0073; P=0.0249); (3)电刺激8 d大鼠PMS表现为植入电极对侧腹部T2值显著增加(P=0.0340); (4)电刺激10 d大鼠PMS发展为植入电极同侧腹部T2值显著增加(P=0.0107)。

2．2 大鼠原发性WEDS与T2-WI信号异常

与我室近期报道的实验结果相吻合［9］: 慢性强直电刺激大鼠CA1基树突区诱发出现的原发性WEDS频率具有明显的可塑性变化,第4天达到高峰。强直电刺激大鼠右背侧海马CA1基树突区第2天时, 双侧背部LV区域T2-WI信号增强, 原发性WEDS频率逐渐升高; 电刺激第4天时, t2-WI信号异常扩布到双侧腹部LV区域, 原发性WEDS频率达到最高峰; 电刺激第6天时, 异常信号累及植入电极对侧的背、 中、 腹部,原发性WEDS频率开始出现下降趋势; 电刺激第8~10天时, 异常信号逐渐扩布到植入电极同侧腹部,此时的原发性WEDS频率继续下降。将原发性WEDS高峰期(电刺激第4天)及其后各实验组大鼠AMS和PMS的T2平均值与相应各组大鼠末次WEDS频率的平均值进行相关分析,结果表明: 行为发作高峰期后, 大鼠原发性WEDS频率与T2-WI信号的异常程度呈高度负相关关系(相关系数r=-0.987, P＜0.02)。说明:原发性WEDS发作高峰期后, 癫痫点燃现象出现之前, 大鼠原发性WEDS出现可塑性下调, 伴随LV区域T2-WI信号异常程度进行性加重。

2．3 组织病理学检测

经组织学鉴定发现: T2-WI信号增强与LV扩大有关, 并发现有脑室脉络膜丛上皮细胞病理性增生现象, 该结果与我室近期的报道一致［5～7］。

3讨论

本项动物实验研究的主要发现有: (1)慢性强直电刺激CA1基树突区诱发的大鼠