摘要：实验用离体血管环张力测定技术, 观察过氧亚硝基阴离子(ONOO-)对离体预收缩的兔肺动脉的舒张反应、肺动脉内皮细胞对舒张反应的影响,并初步探讨其病理意义。结果显示, ONOO-可剂量依赖性引起离体预收缩兔肺动脉舒张。分解的ONOO-也有舒张作用, 但其舒张效应明显低于ONOO-的作用。比较观察表明, oNOO-的舒张效应显著低于硝普钠(SNP)和乙酰胆碱(ACh)。与内皮完整的肺动脉比较, ONOO-对去内皮肺动脉的舒张作用明显增强,剂量依赖性舒张反应曲线明显左移。肺动脉对ONOO-重复作用时的舒张反应有递减趋势。在本实验条件下, ONOO-舒张前后的肺动脉, 对ACh的舒张反应无明差异。结果表明, oNOO-对肺动脉的舒张作用较弱, 此作用受到内皮细胞的抑制性调节并有快速去敏性。过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite, ONOO-)是一氧化氮(nitric oxide, NO)和超氧阴离子(superoxide, o．2)的快速非酶促化学反应产物［1］, 具有明显的氧化作用, 为NO细胞毒效应的主要中介物质。有研究显示, ONOO-还有直接血管活性作用,可引起多种血管舒张［2～4］。我们新近发现, 内毒素可以诱导肺动脉平滑肌生成ONOO-［5］, 引起肺动脉高压［6］。由于ONOO-的生成可以看作O．2是灭活NO,降低NO的舒血管效应, ONOO-可能促进肺动脉高压的形成。本实验在离体兔肺动脉水平, 观察ONOO-引起血管的舒张变化及其特性, 以初步探讨ONOO-在肺动脉高压中的作用。

1材料和方法

1.1 ONOO-的制备用淬灭流动反应方法合成［1］, 略加改良。 0.6 mol/L HCl+0.7 mol/L H2O2与0.6 mol/L naNO2经Y形玻璃管上口灌入混匀, 1.5 mol/L NaOH由底部灌流, 以淬灭前2种溶液的反应。3种溶液使用前4℃预冷, 其灌流的量与速度相同(30 ml, 26 ml/min)。反应后溶液用MnO2 4 g搅拌混匀, 处理1～4 min, 以清除残存的微量H2O2, 在负压下过滤后,置于－20℃环境过夜。上层析出的亮黄色溶液即为ONOO- 储备液。采用紫外色谱分析方法(消光系数ε302=1*#670 m－1cm－1)进行鉴定和浓度定量［1］, 证实在302 nm波长下呈吸收峰。另将部分ONOO- 溶液置于100℃水中温育10 min, 该吸收峰消失, 表明ONOO-已彻底分解, 此溶液即分解的ONOO- (decomposed ONOO- , dec ONOO- ), 降温后于室温保存备用。

1.2 离体兔肺动脉环 (pulmonary arterial rings, PARs) 的制备将兔背位固定于兔台上, 颈部皮肤剪毛后用1%普鲁卡因局部麻醉,分离暴露颈动脉, 并于耳缘静脉注射肝素 (1*#250 U/kg), 放血处死。迅速打开胸腔取出联体心肺, 置于4℃预冷,持续充入95%O2+5%CO2混合气体 (北京普莱克斯实用气体公司) 的Krebs溶液中 (mmol/L: NaCl 118, KCl 4.7, MgSO41.2, KH2PO4 1.2, NaHCO3 25, CaCl2 2.5, glucose 11.1, pH 7.0～7.4)。仔细分离两侧近端的肺动脉,剔除外膜粘附的结缔组织, 把肺动脉剪制成长3 mm的血管环。部分血管环采用磨擦法去除内皮。

1.3 离体肺动脉的张力检测将PARs垂直挂于8 ml夹层器官槽中, 环一端固定于槽底部,另一端通过T1型张力传感器与3066型平台记录仪(四川仪表总厂)相连。 器官槽中灌流液为37℃含环氧酶抑制剂5×10－6 mol/L吲哚美辛(Sigma)的Krebs溶液, 该溶液中持续充入95%O2+5%CO2混合气体。血管静息张力拉至2 g, 6 min后重复一次。之后平衡至少60 min, 每15 min更换器官槽中的Krebs溶液。平衡后用10－６ mol/L α1-受体激动剂苯肾上腺素（phenylephrine, PE,上海天丰）收缩肺动脉至平台, 用新鲜Krebs液冲洗至基线, 以稳定PARs的反应性, 去内皮PARs在预收缩后, 对10－６ mol/L乙酰胆碱（acetylcholine, ACh, Sigma）无舒张反应者为去内皮彻底。然后观察: (1) 用10－６ mol/L pE预收缩的内皮完整PARs, 分别检测ONOO- 、 dec ONOO- 以及硝普钠(sodium nitroprusside, SNP, Sigma)和ACh的累积剂量舒张反应;(2) 去内皮PARs用10－６ mol/L PE预收缩后, 检测ONOO- 的累积剂量舒张反应; (3) 内皮完整的血管环在预收缩后, 观察10－５ mol/L ONOO- 舒张反应, 每次舒张稳定后, 再加同剂量ONOO- , 重复5次; (4) 内皮完整的血管环于ONOO- 累积舒张反应前后,观察预收缩的PARs对10－６ mol/L ACh的舒张反应变化。

在实验中, 舒张反应用舒张张力占PE预收缩张力的百分比表示。

1.4统计学处理数据用mean±SE表示。组间比较用非配对t检验, 前后实验用配对t检验进行分析。

2结果

2.1 ONOO- 的舒张血管作用及与SNP和ACh的舒张作用的比较

oNOO- 可剂量依赖性的引起预收缩的离体兔肺动脉舒张, 引起舒张的阈浓度为10－６ mol/L, 而10－４ mol/L ONOO-引起的舒张程度达(64.35±3.83)%, 5×10－４ mol/L ONOO- 引起了完全舒张。dec ONOO- 也有舒张作用, 在5×10－６～10－４ mol/L各浓度点, dec ONOO- 的舒张效应均明显低于ONOO- 。与ONOO- 相比, dec ONOO- 的累积舒张反应曲线右移, 于10－５ mol/L以上的高浓度点右移较明显。

sNP和ACh均可明显引起肺动脉舒张。与ONOO- 相比, SNP与ACh的累积剂量反应曲线明显左移, SNP和ACh舒张反应的EC50值分别为(2.73±1.87)×10－８ mol/L和(1.70±0.26)×10－７ mol/L, 均显著低于ONOO- 的EC50值(5.63±1.23)×10－５ mol/L (均P＜0.001)。

2.2 去内皮细胞对ONOO- 舒张PARs的影响

与内皮完整的PARs相比, 预收缩的去内皮PARs对ONOO- 的舒张反应明显增强, 舒张反应曲线明显左移。去内皮PARs组EC50值为(1.19±0.29)×10－５ mol/L, 显著低于内皮完整PARs组EC50值(5.63±1.23)×10－５ mol/L, P＜0.001 。

2.3 ONOO- 重复作用时的舒张反应变化

内皮完整PARs预收缩后, 对10－５ mol/L ONOO- 重复作用引起的舒张反应呈递减趋势。ONOO-重复作用引起预收缩肺动脉舒张反应出现快速去敏性原始。

2.4 ONOO- 对内皮功能完整性的影响

血管对ACh的舒张反应变化可体现内皮功能的完整性。在ONOO- 累积剂量舒张反应前后, PARs对10－６ mol/L ACh的舒张反应无明显变化,分别为(70.73±5.26)%和(71.69±7.37)%(P＞0.05)。

3讨论

oNOO- 是一种强氧化剂, 并能衍生多种其它氧化剂, 在体内过量产生时可导致氧化损伤, 介导多种病理过程［7］。我们已经发现, 内毒素休克时肺动脉平滑肌层有ONOO-产生［5］, ONOO- 孵育的离体兔肺动脉可抑制内皮依赖性舒张反应, 低浓度增强而高浓度减弱收缩反应, 表明ONOO-可能是介导内毒素导致肺动脉血压增高的新因素［8］。本实验对ONOO- 的舒张血管特性进行了观察。结果表明, ONOO-可以浓度依赖性地引起预收缩的离体兔肺动脉舒张反应, dec ONOO- 也有舒张作用, 但舒张效应明显低于ONOO-。这与前人报道的结果一致［2,3］。本实验首次就ONOO- 与SNP和ACh的舒张效应做了比较观察, 发现ONOO- 对肺血管的舒张程度远远低于SNP或ACh。实验中SNP释放的NO以及ACh引起肺动脉内皮细胞释放内源性NO的含量低于ONOO-浓度, 提示NO的舒张血管效应明显强于ONOO- 。ONOO- 的舒张效应较低可能具有一定的病理生理意义, 在内毒素血症或休克发病早期,肺动脉生成增多的O．2清除NO, 既可减少内源性舒血管因子含量, 破坏肺循环中舒缩血管活性物质的稳态, 而它们的产物ONOO- 舒张效应又较低, 提示ONOO-在肺动脉平滑肌生成可参与介导内毒素引起的肺动脉压增高。

本实验观察了内皮细胞在ONOO- 舒张血管中的作用, 首先发现去内皮肺动脉对ONOO- 的舒张效应明显增强。因ONOO- 有极强的跨膜弥散能力［9］,动脉内皮细胞菲薄, 对ONOO- 的弥散几乎无影响, 上述结果表明, 离体兔肺动脉内皮细胞对ONOO- 的舒张反应具有抑制性调节作用, 进一步支持ONOO-可能参与内毒素导致肺动脉压增高。有报道, 内皮细胞可释放具有弥散能力的缩血管因子, 并证实此内皮衍生的缩血管因子既非内皮素,也不是环氧酶代谢产物［10,11］。似乎可以推测, 当ONOO- 引起肺动脉舒张时, 肺动脉内皮细胞可释放某种内皮源性收缩血管因子, 参与拮抗ONOO-微弱的舒张作用, 这尚待进一步研究。以往ONOO- 引起血管舒张反应出现快速去敏性(tachyphylaxis)的研究［12,13］,是在离体大鼠灌流心脏和大鼠整体水平上进行的, ONOO- 作用的血管处于静息状态。本实验在有基础张力的兔离体肺动脉上发现, ONOO-引起离体血管的舒张程度亦呈逐渐降低趋势, 因为ONOO- 与Krebs液无明显反应, 提示低剂量的ONOO- 可以改变肺动脉血管壁的反应性, 这可能与ONOO-引起肺动脉舒张反应出现快速去敏性有关。

实验结果还显示, 在观察了ONOO- 的累积剂量舒张反应后, 离体兔肺动脉对ACh的舒张反应影响不大。这与大剂量ONOO- 孵育离体兔肺动脉抑制ACh的舒张反应迥然不同［10］,提示ONOO- 在体内少量生成时对血管内皮功能影响不大, 可能是机体调节NO含量及其生物功能的重要机制, 主要起生理性调节作用。

参考文献

［1］Beckman JS, Beckman TW, Chen J et al. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implication for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87:1620～1624.

［２］Liu SY, Beckman JS, Ku DD. Peroxynitrite, a product of superoxide and nitric oxide, produces coronary vasorelaxation in dogs. J Pharmacol Exp Ther, 1994,268:1114～1121.

［３］Wu M, Pritchard KA, Kaminski PM et al. Involvement of n