摘要：为探讨地塞米松(dexamethasone, DEX)抑制成骨细胞分化的机制, 观察了不同浓度DEX对体外培养大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶活性、 骨钙素(osteocalcin, oC)合成、 Ⅰ型胶原蛋白表达的影响, 并用RT-PCR方法检测了成骨细胞中LIM矿化蛋白1 mRNA的表达量。结果显示: 低浓度(10－９ mol/L)的DEX能增强碱性磷酸酶的活性、 oC的分泌和Ⅰ型胶原蛋白的表达; 而高浓度(10－７ mol/L)的DEX对它们则起抑制作用, 并下调成骨细胞正调节因子LMP-1 mRNA的表达。上述结果表明, 低浓度的DEX促进成骨细胞的分化; 高浓度的DEX则抑制成骨细胞的分化, 其抑制作用可能是通过下调LMP-1 mRNA的表达而实现的。糖皮质激素(GCs)广泛应用于临床, 但流行病学调查发现,长期大量使用GCs会对人体造成包括骨质疏松在内的许多副作用。GCs诱发的骨质疏松是最常见的继发性骨质疏松, 其骨折的发生率高达30%～50%,已成为临床上亟待解决的问题。有研究表明, GCs可通过其受体直接作用于成骨细胞, 从而调节骨代谢。低浓度的地塞米松(dexamethasone, DEX)对成骨细胞的分化有促进作用,而高浓度的DEX则抑制成骨细胞的分化[1～8]; 但其调节成骨细胞分化的机制尚未阐明。近来, Scott等[9]发现, LIM矿化蛋白1(LMP-1)是成骨细胞分化的正调节因子,能促进骨基质的矿化,且低浓度(10－９ mol/L)的DEX可增强LMP-1的表达。然而, lMP-1是否参与高浓度DEX抑制成骨细胞分化的过程, 目前还未见报道。本实验在明确不同浓度DEX对培养大鼠成骨细胞分化作用的基础上, 进一步观察了高浓度DEX对成骨细胞LMP-1表达的影响,以探讨其在DEX抑制成骨细胞分化中的作用。

1材料和方法

1.1材料和试剂SD乳大鼠由河北省实验动物中心提供。其他包括DMEM、 胰蛋白酶(GIBCO公司), 小牛血清(FCS)为自制, 噻唑蓝、 胶原酶、 DEX、β磷酸甘油、 琼脂糖(Sigma公司), Ⅰ 型胶原抗体、 山羊抗兔IgG、 SABC、 DAB(博士德公司), 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)试剂盒(石家庄试剂公司)。骨钙素(osteocalcin, OC)放射免疫法测定试剂盒为中国医学科学技术中心生产。异硫氢酸胍(Serva), randon Primer、 dNTPS(北京鼎国生物工程公司), TagDNA聚合酶、 RNasin、 反转录酶(Promega), PCR引物由上海生物工程公司合成。葡萄糖醛酸脱氢酶（GAPDH）引物上游5′CCCACGGCAAGTTCAACGGCA3′下游5′ tGGCAGGTTTCTCCAGGCGGC 3′此引物可扩增出605 bp的片段。LMP-1引物上游5′CCACGTATGAGCACCTCCTC 3′下游 5′CACAGCTACATACAGGTTTATTG3′ 此引物可扩增出260 bp的片段。还有CO2 培养箱、 全自动酶标仪(奥地利生产)和倒置显微镜(重庆光学仪器厂)， zL2000型细胞参数分析系统由河北医科大学华行医疗器械厂提供。PCR循环仪由美国PE生产。

1.2 大鼠成骨细胞的分离和培养无菌条件下取48 h新生大鼠颅盖骨, 用无血清DMEM冲洗, 再用0.25% 胰酶消化, 清除脂肪和软组织, 剪成1～3 mm3的小块, 用0.1%胶原酶消化45 min, 置于20% FCS DMEM中贴壁培养。所有实验用传至4代细胞, 先用0.25%胰酶消化贴壁细胞,再用含10% FCS的 DMEM调至以下检测所需细胞浓度。

1.3大鼠成骨细胞增殖的分析及ALP活性的测定用含10% FCS的 DMEM调细胞浓度为4×105个/ml, 接种于96孔培养板上0.2 ml/孔,待成骨细胞贴壁后弃去含血清培养基, 在相应的培养孔内分别加入无血清DMEM(作为对照)、 DEX(终浓度为10－９、 10－８、 10－７ mol/L),分别培养24、 48、 72 h, 每一浓度的每一时间点为8孔, 到时弃去培养基, 换用无血清DMEM冲洗培养板3次, 采用MTT法分析细胞增殖。把调至4×105个/ml的细胞液接种于24孔培养板,每孔加入0.4 ml, 以上述方法加入无血清DMEM和不同浓度DEX进行培养, 每一浓度每一时间点有8孔, 待培养到时后进行ALP活性的测定。即弃去培养基,用PBS冲洗培养板3次, 加入0.5 ml 0.1% Triton X100裂解细胞, 收集每孔裂解液, 按试剂盒说明书测ALP活性,用Lawry法测蛋白含量。结果以ALP活性/每克蛋白表示。

1.4 Ⅰ 型胶原蛋白表达及骨钙素分析将细胞接种于6孔培养板(板内预先放置盖玻片), 每孔为105个细胞, 当细胞80%融合时, 选出18个孔,其中6个孔为对照, 其余12个孔加入DEX(终浓度为10－７ mol/L), 分别进行12、 48 h培养, 取出盖玻片, 用PBS冲洗, 多聚甲醛固定20 min, 3% H2O2灭活内源性酶, 再用0.01 mol/L PBS稀释一抗100倍, 加入一抗4℃过夜, 滴加山羊抗兔IgG 37℃ 20 min,再滴加SABC 37℃ 20 min, 用DAB显色5 min, 行脱水、 透明、 封片。用免疫组化方法分析Ⅰ 型胶原蛋白表达。免疫组化结果用ZL2000型细胞参数分析系统测量其光密度。另选出12个孔, 换为10%FBS 5 mmol/L β磷酸甘油 DMEM, 在6个孔内加入10－７ mol/L DEX, 其余6孔为对照, 培养7 d, 收集培养基, 用于骨钙素的测定, 测定方法按放射免疫法试剂盒操作进行。

1.5 RT-PCR检测LMP-1 mRNA的表达第四代细胞80%融合时换为无血清DMEM, 加入DEX(终浓度为10－７ mol/L), 继续培养12、24、 48 h, 不加DEX者作为对照。用异硫氢酸胍-酚-氯仿一步法提取细胞中的总RNA, OD260/OD280鉴定纯度,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性。在反转录体系中加入如下试剂和样品: 5×buffer、 10 mmol/L dNTP、 RNasin、 AMV、随机引物、样品RNA等, 混匀, 42℃水浴30 min, 95℃ 5 min, 以灭活反转录酶。加下列试剂进行PCR反应: 反转录产物、 10×buffer、 primer1、 primer2、 TagDNA聚合酶等, 对GAPDH和LMP-1进行同管扩增。PCR条件为: 首次循环: 95℃变性3 min,58℃退火30 s、 72℃延伸 45 s; 后续循环: 94℃变性30 s, 58℃退火30 s、 72℃延长45 s; 末次循环: 94℃变性30 s,58℃退火30 s、 72℃延长6 min。循环30次。PCR产物于1.5%的琼脂糖凝胶电泳之后进行光密度和面积扫描, 结果以每一样品和其内参光密度的比值表示。

1.6 统计学分析所有实验重复三次。数据用mean±SD表示, 方差检验后, 组间采用非配对t检验。

2结果

2.1 DEX对大鼠成骨细胞增殖的影响

用10－９、 10－８、 10－７ mol/L DEX在培养24、 48、 72 h后, 对大鼠成骨细胞增殖无明显的作用(P＞0.05, 实验数据未显示)。

2.2 DEX对大鼠成骨细胞ALP活性的影响

10－９ mol/L DEX能提高ALP的活性(P＜0.01), 但随培养时间延长, 此作用消失(P＞0.05)。10－８ mol/L DEX,在培养24和48 h后, 与对照比较无明显的作用(P＞0.05), 但当培养至72 h时抑制ALP的活性(P＜0.05)。10－７ mol/L DEX开始就表现出对ALP活性的抑制(P＜0.05),并随时间延长其抑制作用增强(P＜0.01)。

2.3 DEX对大鼠成骨细胞骨钙素的影响

与对照组比较, 10－９ mol/L DEX组的OC明显增高(P＜0.01), 说明10－９ mol/L DEX可促进OC的合成和分泌。而10－７ mol/L dEX的 OC则显著低于对照组(P＜0.05), 表明10－７ mol/L DEX 可抑制OC的合成与分泌。

2.4 DEX对成骨细胞Ⅰ 型胶原蛋白表达的影响

10－７ mol/L DEX处理后的成骨细胞Ⅰ 型胶原蛋白免疫反应明显降低。进而我们用ZL2000型细胞参数分析系统分析Ⅰ 型胶原蛋白的表达。用10－７ mol/L DEX处理的细胞, 无论培养24 h还是培养48 h, 其免疫组化反应的OD值都明显降低, 光密度的平均值小于对照的平均值减2个标准差,说明10－７ mol/L DEX能明显抑制成骨细胞Ⅰ 型胶原蛋白的表达。

2.5 DEX对LMP-1 mRNA表达的影响

循环参数的选择: GAPDH mRNA的表达在PCR 35个循环前呈指数增长, LMP-1 mRNA的表达在PCR40次循环前呈指数增长,所以都选择处于指数增长阶段的30次循环, 将GAGDH和LMP-1进行同管扩增(图2A,B)。LMP-1 mRNA的表达: PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳后,对电泳带作光密度测定。对照组的光密度与内参光密度的比值为0.966。10－７ mol/L DEX培养12、24和48 h后的条带光密度与内参光密度比值分别为0.445, 0.295和0.862。 DEX 培养24 h后, 对 LMP-1 mRNA 表达的抑制达到高峰, 48 h 抑制作用有减弱趋势。

3讨论

本实验结果显示, 低浓度(10－９ mol/L)DEX可提高大鼠成骨细胞ALP的活性, 较高浓度(10－７ mol/L)DEX则抑制ALP的活性。碱性磷酸酶是一种同源二聚体的糖蛋白,是识别及估价成骨细胞分化的生化指标, 而且是成骨细胞分化最早的指标[10,11]。研究发现, OC是骨基质中的主要非胶原蛋白, 为骨组织的特异蛋白,是识别成骨细胞的另一个标志。它和羟磷灰石高度亲和, 和骨基质的矿化有关[10～12]。如果成骨细胞培养环境中缺乏β磷酸甘油, 则不表达OC,所以本实验是在培养基中加入β磷酸甘油后测OC的含量, 发现10－９ mol/L的DEX可促进成骨细胞合成分泌OC, 而10－７ mol/L的DEX抑制OC的合成。以上结果与其它学者的报道一致[1～8],进一步说明不同浓度的DEX对成骨细胞分化的不同作用。而且, Stein 等对大鼠OC启动子的研究表明, 有几个糖皮质激素反应元件对OC的转录活性既可起正调节作用又可起负调节作用[13],为糖皮质激素调控骨钙素的分泌提供了理论依据。本实验结果与此理论相吻合。

大量的流行病学资料显示, 糖皮质激素可诱导骨质疏松症的发生。对此型骨质疏松的防治已成为学者们的研究重点。我们进一步观察到, 较高浓度的(10－７ mol/L)的DEX明显抑制成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达, 减少骨结节的形成。Ⅰ 型胶原占骨有机基质的90%以上, 是成骨细胞分化的又一特征[11], 与细胞的进一步分化有密切关系。本实验中发现, dEX对成骨细胞的增殖并无影响, 说明DEX主要作用在成骨细胞的分化阶段