摘要：为了探讨肺内调节肽在气道各类过敏性炎症发生、发展中的作用，我们观察了血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, vIP)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、内皮素-1(endothelin-1, ET-1)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)在未受应激与臭氧应激两种条件下对支气管上皮细胞(bronchial epithelial cell, bEC)与嗜酸性粒细胞(eosinophil, EOS)粘附的影响。结果发现，VIP、EGF可使O3应激的BEC与EOS的粘附率下降，下调气道上皮炎症反应；ET-1、CGRP可使未受应激的BEC与EOS的粘附率增加，诱发炎症损伤反应；CGRP还能加重臭氧的应激反应；ET-1、CGRP的效应可被W7、H7阻断。抗细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule, ICAM-1)抗体能阻断BEC与EOS的粘附，提示介导BEC与EOS粘附的粘附分子可能是ICAM-1。支气管上皮细胞(bronchial epithelial cell, BEC)常经受多种应激刺激，气道上皮不仅是应激刺激的靶细胞，还可充当传递损伤或炎症信号的前炎症细胞。BEC受刺激后，可通过表达粘附分子、释放多种细胞因子，吸引和募集多种炎症反应细胞,如： 中性粒细胞(polymorphonuclear， PMN)、 嗜酸性粒细胞(eosinophil, eOS)在局部浸润，产生炎症反应，BEC受损伤应激是气道高反应的机制之一。 BEC传递炎症损伤信号可能受到肺内调节肽的调节作用, 一些调节肽如血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)起抑制炎症反应的作用,而另一些调节肽如内皮素-1(endothelin-1, ET-1)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)等可能促进和放大炎症反应。为验证这一假说,本研究通过测定BEC与EOS的粘附率, 观察了四种调节肽的调节作用及机制, 初步探讨了肺内调节肽在炎症发生发展中的作用。

1材料和方法

1.1 材料实验动物：新西兰兔(1.5±0.3 kg), 雌雄不拘。 RPMI 1640培养基, 胰蛋白酶、 vIP、EGF、ET-1、CGRP、H7(PKC抑制剂)、W7(钙调素抑制剂)均为Sigma产品；青/链霉素、胎牛血清(fetal bovine serum, fBS) 均为国产； 小鼠抗兔ICAM-1抗体(北京中山)；臭氧发生器(湖南有色金属研究院)；723型可见分光光度计。

1.2 兔BEC的分离和培养新西兰兔, 兔耳静脉麻醉, 股动脉放血处死, 无菌条件结扎支气管端。 喉端注入含0.05%胰蛋白酶的1640至充盈封口结扎,于37℃作用 1 h, 剪开支气管, 2.5% FBS终止反应。 用支气管刷刷洗BEC, 悬浮于D-hanks中, 离心3次,细胞计数稀释成106个/ml。用台盼蓝排斥法计数成活率88±2.2%, Wright染色纤毛上皮细胞占84±2.4%, 用含5% FBS以及青/链霉素的1640配成悬液,1×106个/孔接种入鼠尾胶原包被的24孔板, 于37℃ 5% CO2培养, 24 h后换无血清培养基, 接种24 h后显微镜下气道上皮细胞呈单层生长,粘壁率约为40%~60%。

1.3 兔外周血EOS的分离采集兔外周静脉血, 用0.5%肝素抗凝, 与4%多聚葡萄糖(glucan400)生理盐水按2∶1的体积比于室温放置1 h,取富含白细胞的上层液离心并溶RBC, 回收的白细胞置于淋巴细胞分离液（体积比=1∶1)中, 2000 r/min离心 10 min,将下层细胞加入到不连续密度梯度Pecoll上, 1500 r/min离心 15 min, 收集介于1.095～1.100 g/ml之间的细胞层,细胞计数为1×106个/ml, 台盼蓝排斥法计数成活率86±4.4%, Wright染色纯度84±3.6%。

1.4 EOS与BEC粘附率测定[1]BEC在标准的24孔板长至融合, 测定前移去培养基, 每孔用1640洗涤一次, 各调节肽预处理组于37℃ 孵育2 h后,未应激组置于室温2 h , 臭氧应激组在室温中以臭氧攻击2 h 。本室先前实验研究发现, 将细胞置于1.5 ppm的臭氧箱中暴露2 h, 细胞毒指数明显增加,细胞应激反应显著增强[2]；臭氧攻击还可使BEC一氧化氮释放增加, 一氧化氮是具有自由基性质的气体信使分子[3], 是细胞损伤的标志,用臭氧攻击建立细胞损伤模型, 其结果稳定可靠。处理结束后移去培养基, 将纯化的EOS于37℃10 min预热, 以0.1×106个/孔加入24孔板,终体积0.25 ml, 37℃ 15 min后, 轻轻摇动培养板, 弃上清并用1640洗涤1次, 去除未粘附EOS, 保留的粘附细胞加入0.25 ml 0.5% cetrimid提取细胞中的过氧化物酶(预实验观察发现BEC不含过氧化物酶), 取50 μl上清加入150 μl底物, 室温作用30 min, 以2 mol/L h2SO4 50 μl终止反应, 测OD492, 一系列稀释的EOS做标准曲线, 求粘附率。

1.5 通过抗ICAM-1抗体观察对粘附的阻断作用 为了验证介导 BEC与 EOS粘附的分子是ICAM-1, 在各预处理的 BEC 中加入抗细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule, ICAM-1) 抗体, 然后将纯化的 EOS加入24孔板, 通过测定粘附率观察抗 iCAM-1抗体对粘附的阻断, 并作为阴性对照。

1.6 实验分组及统计学处理实验分组： (1)未受应激组; (2) VIP处理组; (3) EGF处理组; (4) ET-1处理组； (5) CGRP 处理组,并观察W7、 H7的调节作用；(6) O3应激组; (7) VIP＋O3 处理组; (8) EGF＋O3处理组; (9) ET-1＋O3处理组及(10) cGRP＋O3 处理组, 并观察W7、 H7的调节作用。

统计学处理：数据均以mean±SD表示, 采用方差分析。

2结果

2.1VIP对兔BEC与EOS粘附的影响

vIP(10－８ mol/L)对未经O3应激的BEC与EOS的粘附无影响;O3攻击2 h使BEC与EOS的粘附率显著增加, 粘附率从6.8%增加到8.8%, p＜0.05, VIP(10－８ mol/L)预处理后使O3应激的BEC与EOS的粘附率相对于O3应激组显著下降（P＜0.05), 可见O3攻击对BEC有显著的应激作用, vIP可减轻BEC的炎症损伤反应。

2.2 EGF对兔BEC与EOS粘附的影响

eGF (20 ng/ml)对未经O3应激的BEC与EOS的粘附无影响； EGF (20 ng/ml)预处理后使O3应激的BEC与EOS的粘附率相对于O3应激组显著下降（P＜0.05）,提示EGF可减轻BEC的炎症损伤反应。

2.3 ET-1对EOS与兔BEC粘附功能的影响

eT-1(10－８ mol/L)使BEC与EOS的粘附率显著增加, W7(10-4 mol/L)、H7 (10-5 mol/L) 可阻断ET-1的效应, 提示 eT-1的促粘附作用呈[Ca2+]与PKC依赖性。O3应激后, ET-1的促粘附作用不与O3应激效应叠加。

2.4 CGRP对EOS与兔BEC粘附功能的影响

cGRP (10－８ mol/L)使BEC与EOS的粘附率显著增加, W7 (10-4 mol/L)、H7 (10-5 mol/L)可阻断CGRP的促粘附效应,提示 CGRP的作用呈[Ca2+]与PKC依赖性。CGRP (10－８ mol/L)预处理后, O3应激的BEC与EOS的粘附率显著增加, CGRP在诱发加重炎症反应中起重要作用。

2.5 抗ICAM-1抗体对粘附的阻断作用

抗ICAM-1抗体对各组BEC与EOS的粘附效应均有明显的阻断作用, 说明ICAM-1是介导BEC与EOS粘附的主要粘附分子。

3讨论

eOS是气道各类过敏性疾病发生的重要参与者。 EOS激活后, 可上调粘附分子的表达, 并与BEC表达的ICAM-1结合, 脱颗粒,产生活性氧代谢产物、脂类介质、蛋白酶类物质、细胞因子等, 通过多种途径介导组织损伤, ICAM-1为介导BEC与免疫细胞浸润粘附的主要粘附分子。VIP、ET-1、CGRP、EGF是广泛分布于人和动物呼吸系统内的调节肽。许多研究发现VIP具有显著的抗炎、抗损伤作用；VIP可抑制EOS释放和粘附功能[4], vIP参与某些抗活性氧的酶蛋白的合成, 具抗损伤保护作用[2]。EGF可能是上皮增殖及损伤修复的重要细胞因子,对有丝分裂、细胞周期及细胞的粘附能力有明显的促进作用[5];此外, EGF 对支气管上皮细胞具有抗臭氧损伤保护作用[6]。本实验发现, VIP、EGF可以降低臭氧应激的BEC与EOS的粘附,提示这两类调节肽可抑制气道上皮的炎症或损伤反应, 减轻气道高反应的发生,具有一定意义的保护作用。其作用可能与它们抑制粘附分子ICAM-1的表达及细胞因子的释放有关。ET-1是近年来研究较多的肺内神经肽,它对炎症过程也有显著的影响。ET-1可刺激细胞多种炎症介质和细胞因子的分泌,并可引起细胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1的表达增加。CGRP能抑制平滑肌细胞的增殖, 促进上皮细胞的增殖, 具有抗损伤能力[7],并与速激肽一起参与神经源性炎症反应；CGRP通过刺激粘附分子的表达而增加免疫细胞的募集、粘附[8],以及通过增加肿瘤细胞与基质细胞的粘附增加肿瘤的侵袭力[9]。实验发现, ET-1、CGRP使BEC与EOS的粘附显著增加, 此过程呈Ca2+和PKC依赖性, cGRP还可增加臭氧应激的BEC与EOS的粘附, 诱发加重炎症反应。提示这两类调节肽可上调气道上皮细胞的炎症损伤信号传递,放大炎症反应。BEC与EOS的粘附与ICAM-1的表达有关。

参考文献

[1]Jagels MA, Daffern PJ, Zuraw BL, Hugli TE. Mechanisms and regulation of polymorphonuclear leukocyte and eosinophil adherence to human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol, 1999, 21(3):418~427.

[２]Qin XQ (秦晓群), Sun XH (孙秀泓), Zhang CQ (张长青). Cytoprotective effects of vasoactive intestinal peptide on rabbit bronchial epithelial cells damaged by ozone exposure. Chin J Appl Physiol (中国应用生理学杂志), 1998, 14:250~253.

[３]Qin XQ (秦晓群), Xiang Y (向 阳), Luo ZQ (罗自强), Zhang CQ (张长青), Sun XH (孙秀泓). fibronectin or RGD peptide promotes nitric oxide synthesis of rabbit bronchial epithelial cells. Acta Physiolo Sin (生理学报), 2000, 52(6):519~5