摘要：研究者普遍认为糖蛋白激素存在于促性腺激素(gonadotrophin, GTH)细胞的颗粒内,目前在生殖内分泌领域内对糖蛋白激素形成与释放的研究也主要集中在细胞内颗粒的变化上。我们近年的研究发现, 大鼠垂体GTH细胞内黄体生成激素(luteinizing hormone, LH)的分泌与细胞内液泡的形态变化有密切的关系, 细胞的形态也随液泡的形态变化而变化,因而推测“LH的储存与释放可能与液泡有极大的关系”。为进一步揭示垂体细胞的液泡内是否存在LH和探讨哺乳动物垂体细胞的液泡是否具有储存与释放LH的功能,本研究对大鼠垂体细胞的液泡进行了分离和纯化, 用SDS-PAGE、 Western immunobloting及Con A/HRP等方法分别对纯化的垂体、大脑皮层及肝脏组织的液泡进行了蛋白质、 LH及糖蛋白的分析。结果显示: (1)垂体、 皮层及肝脏细胞的液泡内均含有丰富的、 分子量大小不等的蛋白质成分,不同组织的细胞液泡内蛋白质成分有许多是相似的; (2)垂体组织及其液泡内均含有LH, 而且在相同浓度的蛋白量中, 两者LH的水平并无明显差异; (3)垂体、皮层和肝脏组织液泡内均有分子量不同的糖蛋白, 但只有垂体细胞的液泡内才有与LH位置相同的糖蛋白染色谱带。上述结果表明:虽然哺乳动物不同组织的细胞液泡内含有许多相似的蛋白质成分, 但LH是特异性地存在于垂体细胞液泡内。在这些LH分子中, 至少有一部分是已经装配了糖基的完整LH分子。因此,垂体细胞的液泡有可能具有储存与释放LH的功能。目前对哺乳类垂体促性腺激素分泌活动的研究主要是应用细胞形态学方法, 以及观察细胞内致密颗粒的形成和释放［1,2］, 然而, 在黄体生成激素(luteinizing hormone, LH)分泌过程中, 细胞内的液泡也发生了一系列有规律性的变化。在我们近年的研究中发现, 虽然促性腺激素细胞的细胞质内的颗粒存在大量的LH,但是在LH分泌过程中, 垂体细胞的大小与形态是随着液泡的大小和形态的变化而变化的。当LH 大量分泌时, LH颗粒的数目随液泡数目和体积的增加而减少,而且血液中测得的LH 水平高峰是在大量液泡破裂后的短暂阶段, 因而我们推测, LH的储存和释放可能和液泡的变化有关［3~6］。然而,由于细胞形态学方法存在的局限性, 难以使细胞内的液泡产生强的染色反应, 因而本研究对大鼠垂体细胞的液泡进行了分离和纯化, 通过分析液泡内可溶性蛋白质、黄体生成激素及与LH相关的糖基, 以期为“LH的储存和释放可能与液泡变化有关”的推断提供一些直接的证据。

1材料和方法

1.1 动物Spraque-Dawley 大鼠(200~250 g; 中英合作SIPPR/BK实验动物中心提供)按雄性、雌性及去卵巢雌性动物分别随机取样组成三组, 每组动物数均为30只。去卵巢雌性动物为经腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg体重)麻醉后切除双侧卵巢1个月的动物。

1.2 液泡的制备与纯化动物断头处死后, 立即取垂体、 大脑皮层和肝组织, 置于4℃, 用预冷的生理盐水洗净。液泡的分离与纯化按Phillips的方法［7］,稍作改变。洗净的组织用滤纸吸去水分后转移至预冷的0.3 mol/L蔗糖等渗溶液中, 在冰浴条件下用组织切碎机将组织切碎成匀浆状, 然后1?000 g离心15 min, 弃去沉淀。 悬浊液经16?000 g离心30 min, 沉淀中加入7 ml 的0.3 mol/L蔗糖介质, 搅匀后再次16?000 g离心30 min, 沉淀中加入0.5 ml 的0.3 mol/L蔗糖介质, 搅匀并悬布在非连续蔗糖密度梯度介质(自上而下由0.4、 0.6和0.8 mol/L蔗糖介质组成)的上端, 经20?000 g离心40 min, 吸取0.6 mol/L蔗糖介质界面以上的液泡带, 用同体积0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.2)混匀。再经16?000 g离心20 min, 倾去上清液, 沉淀中加入100~150μl的0.3 mol/L蔗糖介质,混匀后沾取一小滴置于干净的载玻片上, 在光学显微镜和相差显微镜下观察分离纯化后的液泡形态, _ㄒ号莸拇慷取Ｎ徊饺范ㄒ号莸恼嫖?亦用中性红对液泡进行染色并用免疫生化方法分析液泡特征性的酶。在上述液泡制备与纯化过程中, 蔗糖介质均以0.05 mol/L的Tris-HCl 缓冲液(pH7.2)配制, 离心等操作在4℃条件下进行。垂体组织的蛋白质提取按常规方法进行, 即任取垂体3只, 加0.05 mol/L的Tris-HCl 缓冲液(pH7.2)制作成匀浆后, 16?000g离心15 min, 上清液储于－30℃保存。

1.3 液泡内可溶物的提取为避免液泡膜上的物质被提取, 将纯化后的液泡置于－30℃, 2h后取出置于室温融化, 反复冻融３次使液泡彻底破裂。10?000 g离心15 min, 用微量进样器小心吸取上清液储于－30℃保存。沉淀中(保留 5 μl左右的上清液)加入20 μl的Leammli样品缓冲液［8］,沸水浴处理3min用于液泡特征性标志酶的分析。

1.4 液泡的特异性标志酶的分析基本按Towbin等的方法［9］分析液泡的蛋白水解酶A (proteinase A)［10］。4 μl样品经0.1%SDS-10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维膜(HybondTM-Hybridization)。取出NC膜浸入含1%牛血清白蛋白、0.05% Tween-20的PBS溶液(pH 7.4), 室温阻断过夜, 一抗为抗液泡特异性蛋白水解酶A抗体(由日本东京大学Dr.Yoh Wade馈赠),二抗为生物素处理的HRP标记的羊抗兔IgG抗体, 用标准ABC方法(Vectastain ABC kit,Vector Lab.Burlingame, uSA)进行染色, 显色剂为NBT (氮蓝四唑)和NADH。

1.5 液泡蛋白质成分的分析液泡内含物中蛋白质浓度按Spector方法［11］测定。蛋白质成分的分析基本按Laemmli方法［8］进行。凝胶为0.1% sDS-10% 聚丙烯酰胺, 蛋白质加样量均为10 μg。电泳完毕后, 凝胶上的蛋白质检测按Kirkeby等方法［12］进行银染。

1.6 LH的免疫检测 5μg液泡蛋白质样品经SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维膜, 用标准的ABC方法检测LH。豚抗鼠LH抗体(anti-rat LH beta-IC-2 antisera, CYTO rat LH-I-9, IDO, 由NIDDK惠赠, USA)用PBS稀释1?000倍作一抗, 生物素处理的HRP标记的羊抗豚IgG用PBS稀释200倍作二抗。显色剂为3,3′-二氨基联苯胺/H2O2。

1.7 糖蛋白的分析10 μg液泡蛋白质样品经SDS-PAGE分离后转移至硝酸纤维膜, 按Weiss等的Con A-HRP方法［13］对含甘露糖、葡萄糖及葡糖胺配基的糖蛋白进行检测,显色剂仍为3,3′-二氨基联苯胺/H2O2 。

2结果

2.1 液泡纯度与标志酶的鉴定

大部分的液泡体积为中等大小以上, 在显微镜下对液泡进行计数, 按本方法获得的液泡纯度至少达到95%以上。

2.2 蛋白质成分的分析

sDS-PAGE分析, 所有样品中均含有十分丰富的、 分子量大小不等的蛋白质成分。不同性别的大鼠垂体液泡内蛋白质成分基本是一致的; 垂体、皮层和肝细胞的液泡内蛋白质成分亦大部分相似; 垂体组织与液泡内蛋白质成分虽然有不少相似, 但两者的差异比液泡间蛋白质成分差异明显。

２.3 LH的检测

结果显示, 只有垂体液泡与垂体组织含有与LH抗体呈显著反应的谱带, 皮层和肝细胞的液泡不存在LH。

２.4 糖蛋白成分的检测

分析的所有样品中均含有丰富的糖蛋白成分, 但与LH分子位置相同的糖蛋白谱带仅存在于垂体液泡内。

3讨论

早在1937年Severinghas就已观察到去卵巢后的大鼠垂体促性腺激素(gonadotrophin, GTH)含量明显增加, 同时细胞内液泡也增多或增大,因而推测GTH含量的增加可能存在于颗粒内, 也可能存在于液泡中, 或两者内都存在。但大量的组织化学和免疫组织化学研究却表明,在垂体细胞内只有颗粒能与Schiff试剂或LH抗体产生强的染色反应。在近年的研究中, 我们对内分泌细胞液泡的形成和发展作了比较详尽的了解,发现虽然促性腺激素细胞的胞质内颗粒存在大量的LH, 但是在LH分泌过程中, 不仅垂体细胞的大小与形态是随着液泡的大小和形态的变化而变化的, 而且LH颗粒的数目随液泡数目和体积的增加而减少,更重要的是血液中测得的LH 水平高峰是在大量液泡破裂后的短暂阶段。这些结果强烈地提示液泡可能具有储存和释放促性腺激素的功能［3~6］。然而,与其他研究垂体促性腺激素分泌的手段相似, 我们过去均采用细胞形态学方法。为了直接证实LH的储存和释放可能与垂体细胞的液泡有关,有必要获得纯化的垂体细胞液泡并对液泡的内含物进行分析。

本研究运用等渗蔗糖溶液分步离心和非连续蔗糖密度梯度离心方法, 获得了纯度大于95%的液泡。除观察液泡形态和用特征性染色外,我们还用免疫印迹方法对液泡的特征性标志酶蛋白水解酶A［10］进行了分析(图1), 证实了我们获得的应是液泡而不是细胞残片或其它的细胞器。已经知道,植物和微生物细胞的液泡都存在H+-ATPase、 Cl－ 转运系统及K+通道等, 这些物质的存在不仅使液泡内部保持酸性环境, 而且提供了跨液泡膜的质子动力,因而液泡具有储存物质的功能; 另外液泡内含有各种不同的水解酶［10］, 使液泡内蛋白质、 多糖和多核苷酸水解,所以液泡又具有对大分子物质消化和代谢的功能［14］。本研究观察到不同组织的液泡内有许多蛋白质成分的分子量基本相同(图2)。我们认为液泡内具有不少相似分子量蛋白质成分的特征是合理的,因为既然液泡具有许多相似的功能, 那么组成液泡内重要活性物质之一的蛋白质或酶也理应有许多是相似的。然而, 因组织和细胞类型不同,组成不同细胞的物质以及不同细胞的代谢产物相互间自然也有所不同, 这反映在不同组织的液泡内蛋白质成分不尽相同。由于垂体细胞的液泡是垂体细胞的一部分,故两者的蛋白质成分亦应有部分的相似。

免疫印迹方法对纯化的液泡内LH的检测结果显示, 只有垂体细胞液泡内存在与LH抗体反应的特异谱带, 该谱带的位置和染色密度与垂体组织的LH谱带相仿(图3)。换言<