摘要：采用夹闭大鼠腹腔动脉30 min，松开动脉夹血流复灌1 h的胃缺血-再灌注损伤(gastric ischemia-reperfusion injury, gI-RI)模型，观察了电或化学刺激室旁核(paraventricular nucleus, PVN)及外源性加压素(arginine-vasopression, aVP)对GI-RI的影响，并对PVN的调控通路进行了初步分析。结果表明：电或化学刺激PVN后，GI-RI显著减轻; 损毁双侧孤束核(nucleus tractus solitarius, NTS)或一侧NTS内注射AVP-V1受体阻断剂，均能取消电刺激PVN 对GI-RI的效应; 去除脑垂体后不影响PVN的作用;切断膈下迷走神经或切除腹腔交感神经节，则能加强电刺激PVN对GI-RI的影响; PVN内注射不同剂量的AVP同样能减轻大鼠GI-RI损伤。结果提示：PVN及AVP对大鼠GI-RI具有保护作用; pVN的这种作用可能是因电或化学刺激后，激活了其中的加压素能神经元，经其下行投射纤维释放AVP作用于NTS神经元的AVP-V1受体，并通过迷走和交感神经介导，从而影响GI-RI;而似与PVN-垂体通路关系不大。下丘脑室旁核(paraventricular nucleus, PVN)是一个结构和功能非常复杂的神经核团, 它既有合成和分泌加压素(arginine-vasopressin, aVP)和催产素的神经内分泌大细胞, 又有合成和分泌多种递质、 调质的神经分泌小细胞,它所合成和释放的AVP作为重要的神经递质和应激激素参与对心血管、痛觉和应激反应的调节[1~3]。PVN中加压素能神经元发出的纤维不仅直接投射到脑垂体,而且还投射到孤束核、蓝斑和中缝大核以及脊髓中间外侧柱的交感低位中枢等部位[4~6] , 同时有资料表明, 在大鼠、 小鼠的PVN及孤束核(nucleus tractus solitarius, NTS)分布有丰富的AVP受体[2,7,8]。

近年来, 我们实验室进行的PVN及其相关核团(蓝斑和中缝大核)对大鼠应激性胃粘膜损伤影响的研究表明,它们对其具有重要的调控作用[9]。临床上各种原因(诸如出血性休克、消化道溃疡出血、 内脏血管破裂等)所致的胃缺血-再灌注损伤(gastric ischemia-reperfusion injury， GI-RI), 实质上也属机体的应激反应。PVN及加压素是否参与对GI-RI的调控,尚未见报道。为此, 本文观察了刺激PVN及外源性AVP对大鼠GI-RI的影响, 并初步分析了PVN调控的神经机制。

1材料和方法

1.1 实验动物实验选用成年健康的Sprague-Dawley雄性大鼠(180～220 g), 由徐州医学院实验动物中心提供。

1.2 外科手术 全部动物采用戊巴比妥钠 (30 mg/kg, i.p.)麻醉, 术后3 d进行实验。

1.2.1 大鼠去垂体的制备采用朱传江法[10], 沿颈中部近下颚处作纵向切口, 分离组织, 沿基枕骨中脊向头端剥离, 可见“T”形突起。在此上方2 mm与“T”形突起的纵行延长线交界处, 用限钻钻孔。钻通后插入吸嘴, 开动真空泵, 仔细吸取垂体, 术后给予地塞米松和抗菌素, 自由饮用葡萄糖水;假手术组仅用限钻钻孔, 保留垂体。实验后查看去垂体组蝶鞍区有无残留垂体, 若有残留则不列入统计。

1.2.2 膈下迷走神经切断参照Mordes等[11]方法, 打开腹腔后, 在距贲门5 mm处的食管前后壁, 切断迷走神经前、 后枝。

1.2.3 腹腔交感神经节切除采用Alm等[12]方法, 将胃肠推向腹腔右上方, 在腹腔动脉、 腹主动脉和肠系膜上动脉间可见灰白色的交感神经节,用有齿眼科小镊钝性分离并去除之, 并对切除的组织作组织学鉴定; 假手术组仅开腹, 尔后缝合。手术结束后, 再行核团埋藏电极、 套管或损毁。

1.2.4 核团埋藏电极、 套管及电解损毁动物头固定于立体定位仪上, 按照Paxinos和Watson脑图谱[13]及我们以前的方法[9]将外径0.4 mm、内芯尖端裸露0.5 mm的同心圆刺激电极插入右侧PVN(坐标：AP 1.5 mm, R 0.4 mm, H 7.7~7.8 mm, 门齿瓣低于耳间连线3.3 mm), 用502胶及自凝牙托粉固定。刺激PVN的参数为单相方波, 波宽0.2 ms, 强度分别为0.2、 0.4 mA, 频率50 Hz, 持续1 min。刺激脉冲由刺激器产生并通过隔离器恒流恒压输出, 每间隔10 min刺激一次, 共5次, 刺激完毕立即行胃缺血-再灌注; 假电刺激组只埋藏电极,不予电刺激。

电损毁NTS: 仍按以上图谱, 用直径0.3 mm、 尖端裸露0.3 mm的绝缘不锈钢针插入两侧NTS (坐标: AP 13 mm, L或R 0.6~0.8 mm, H 7.7~7.8 mm), 通以阳极直流电(1 mA、 10 s)进行电损毁; 假损毁组只插针不通电。

1.2.5 PVN、 NTS内微量注射于GI-R前10 min进行。按上述坐标定位, 用微量注射器在2 min内将新鲜配制的3%L-谷氨酸或AVP-V1受体阻断剂 （deamino-Pen1,Val4,D-Arg8-vasopressin） 0.5 μl分别缓慢注入一侧PVN或NTS内,留针3 min; 对照组以同样方法注入等量生理盐水。AVP为RBI公司产品, AVP-V1受体阻断剂为Sigma公司产品。实验时均用生理盐水配制, pH6~7。

1.3 大鼠胃缺血-再灌注损伤的制备按Wada等[14]方法进行。实验前禁食24 h, 自由饮水。实验时, 乌拉坦(1 g/kg, i.p.)麻醉后, 将3 d前已手术的大鼠开腹, 仔细分离腹腔动脉与周围组织后, 用小动脉夹夹闭腹腔动脉30 min后去除, 恢复血流再灌注60 min。实验结束后取胃,于10%的福尔马林溶液中固定30 min, 以备作胃粘膜损伤指数的测量。

1.4 胃粘膜损伤指数的测量将已用福尔马林溶液固定的胃沿大弯侧剪开、冲洗、 展平, 采用Guth等[15]方法测量计算损伤指数(damage index, dI)作为胃缺血-再灌注损伤的指标。 其具体做法是：以局限于胃上皮的点状糜烂、溃疡、 出血灶的长度累积计分：0分为正常, 1分≤1 mm, 2分≤2 mm,3分≤3 mm, 余类推; 损伤宽度超过1 mm时加倍计分。每组大鼠损伤分数的平均值即为DI, 由不参与本实验的人员计数。

实验完毕, 各组动物经电极通以阳极直流电(1 mA、 10 s)进行损毁标记, 取脑固定于1%的亚铁氰化钾福尔马林溶液中, 5~7 d后作冰冻切片、 染色,鉴定刺激、 损毁及注射部位, 定位不准者弃去。

1.5 统计学处理实验数据以mean±SD表示, 多组间比较采用完全随机设计方差分析法(ANOVA)。以P＜0.05为有显著性统计学差别。

2结果

根据Paxinos和Watson脑图谱[13], 对实验中所有核团的刺激、 损毁和注射部位进行了组织学鉴定, 其中电刺激PVN及NTS电损毁、微量注射的组织学。

2.1 电或化学刺激PVN对大鼠GI-RI的影响

以单纯GI-R作为对照组， 分别用0.2和0.4 mA电刺激PVN, 能明显减轻GI-RI。 经统计学处理, 与对照组和假电刺激组相比有显著性差异(P＜0.05或0.01)。表明电刺激PVN对胃粘膜损伤具有保护作用。

将神经元胞体兴奋剂L-谷氨酸(L-Glu)注入一侧PVN再进行GI-R后的胃粘膜DI(n=7)与一侧PVN内注入配药液(生理盐水)组(n=7)相比,差异具有显著性(P＜0.05), 而与电刺激PVN组的效应相似。表明电刺激PVN减轻大鼠GI-RI系因该核团神经元胞体受刺激而兴奋所致。

2.2 孤束核在电刺激PVN对大鼠GI-RI调控中的作用

双侧假损毁NTS+假电刺激PVN+GI-R作为对照组(n=8), 假损毁NTS+0.4 mA电刺激PVN+GI-R组(n=6)的胃粘膜损伤与对照组相比明显减轻,具有显著性差异 (P＜0.05); 损毁双侧NTS+0.4 mA电刺激PVN+GI-R组(n=6)的DI与对照组相似, 而与假损毁NTS+电刺激PVN+GI-R组相比,胃粘膜损伤加重, 差别具有显著性 (P＜0.05)。表明损毁NTS能消除电刺激PVN对GI-RI的保护作用, 提示NTS可能参与PVN对GI-RI的调控。

一侧 NTS 内注射配药液(生理盐水) 0.5 μl+电刺激 PVN+GI-R(n=7)作为对照组, NTS 内注射AVP-V1 受体阻断剂 200 ng(0.5 μl)+电刺激 PVN+GI-R组 (n=6) 胃粘膜损伤比对照组明显加重, 两组之间具有显著性差异 (P＜0.05)。说明NTS内注射 AVP-V1受体阻断剂可阻断电刺激 PVN对GI-RI 的保护作用, 提示电刺激 PVN 对大鼠 GI-RI 的调控可能是通过 NTS 内的AVP-V1 受体实现的。

2.3 脑垂体在电刺激PVN对大鼠GI-RI调控中的作用

脑垂体假手术+GI-R作为对照组(DI为135.00±20.69, n=7); 去垂体+0.4 mA 电刺激 PVN+GI-R组DI与对照组相比明显减轻 (DI为 56.62±35.48, n=8), 两组间差异具有显著性(P＜0.01), 而与脑垂体假手术+0.4 mA电刺激PVN+GI-RI组(DI为58.63±19.74, n=6)相比, 差别无显著性 (P＞0.05), 表明脑垂体似不参与电刺激PVN对GI-RI的调控作用。

2.4 迷走、 交感神经在电刺激PVN对GI-RI调控中的作用

腹部假手术+GI-R作为对照组(DI为137.14±27.63, n=7); 腹部假手术+0.4 mA电刺激PVN+GI-R组(n=7)与对照组相比,胃粘膜损伤明显减轻, 两组间差别具有显著性(P＜0.01); 切断膈下迷走神经(n=6)或去除腹腔交感神经节(n=6)后, 分别用0.4 mA的电刺激PVN,其GI-R的胃粘膜DI与腹部假手术+电刺激PVN+GI-R组相比, 胃粘膜DI分别减低了70.31%和57.03%, 差异均有显著性(P＜0.01),表明迷走神经、交感神经均参与PVN对GI-RI的调控作用。

2.5 PVN内注射AVP对大鼠GI-RI的影响

pVN内注射生理盐水0.5 μl＋GI-R作为对照组, 其胃粘膜DI为143.78±64.31(n=7), PVN内分别注射AVP 75、 150、 300 ng/0.5 μl＋GI-R组, 其胃粘膜DI分别为95.67±79.26(n=6), 71.67±39.01(n=6),33.5±12.16(n=6)。各剂量组与对照组相比均有显著性差别 (P＜0.05或0.01), 表明PVN内外源性AVP对大鼠GI-RI也具有明显的保护作用。

3讨论

室旁核(PVN)是调节内脏活动的较高级中枢, 它对生理及应激