摘要：为探讨雌激素对大鼠杏仁核(amygdala, Amy)与纹状体 (striatum, Str)多巴胺(dopamine, DA)代谢的作用,本实验采用离体电化学检测技术高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)测定正常雌鼠及经雌激素处理的去卵巢(ovariectomy, oVX)雌鼠Amy和Str的DA及其代谢产物的组织含量。实验结果显示, OVX雌鼠经雌激素处理后, 可引起Amy的DA及其代谢产物含量减少, 而Str的DA及其代谢产物含量不受其影响。OVX雌鼠Amy的DA更新率低于正常及雌激素处理的OVX鼠, amy组织的DA含量约是Str组织的1/6, 而更新率是Str的2倍左右。以上结果提示, 雌性大鼠血清雌激素浓度可影响其Amy组织的DA代谢及组织含量, 而Str的DA组织含量不因雌激素浓度的改变而变化。大量研究表明, 雌鼠纹状体的多巴胺(dopamine, DA)释放量、含量, 以及DA受体密度和亲和力等有着动情周期依赖性变化,而雌激素作为雌鼠体内的主要性激素是引起这种动情周期依赖效应的主要原因。近年来, 许多学者认为中脑边缘系统的DA通路在DA功能中的作用不容忽视。其中, 杏仁核(amygdala, amy)在神经退行性疾病帕金森病(Parkinson′s disease, PD)发病过程中的严重受累[1], 使得人们更加重视对中脑边缘系统 DA能神经通路的研究。 本室以前的工作表明, 电刺激腹侧被盖区诱发杏仁核的DA释放具有性别差异, 雌鼠明显高于雄鼠[2],而电刺激内侧前脑束诱发纹状体(striatum, Str)的DA释放未发现性别差异(待发表资料)。由此我们认为杏仁核在PD发病率显示明显性别差异[3]的现象中有着重要的作用。本研究在前期工作的基础上,通过采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC), 在去卵巢(ovariectomy, OVX)大鼠及雌激素处理大鼠身上探讨雌激素对Amy以及Str的DA含量的影响,以期能更好地解释临床常见的运动紊乱综合症如PD发病率的性别差异, 以及雌激素在Amy和Str组织中的作用。

1材料和方法

1.1实验动物、 用药及分组实验选用体重为200~300 g的成年雌性Wistar大鼠, 置于室温19±2℃, 24 h昼夜循环光照条件下生活, 自由饮水、进食。动物于实验前适应实验室环境1周。实验用药苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate, EB)由上海第九制药厂生产, 用芝麻油稀释, 终浓度为5、10 μg/0.1 ml。

实验共分六组, 分别为(1)正常对照组; (2)OVX组; (3) 5 μg EB剂量组; (4)10 μg EB剂量组; (5)20 μg EB(即10 μg eB, 2次/d)剂量组; (6) 替代剂芝麻油(oil)组。正常对照组大鼠在实验前至少10 d接受去卵巢假手术, 其它各组大鼠需在实验前至少10 d接受去卵巢手术, 并根据不同实验要求皮下注射EB或oil 3 d 。

1.2 卵巢摘除术方法将雌鼠麻醉后, 在腰背部中央剪开皮肤, 切口约2～3 cm, 令动物一侧卧, 在最末肋骨下约1 cm, 沿脊柱旁切开肌肉, 打开腹腔,结扎并切除卵巢, 观察切口处无出血后关腹; 再令动物侧向另一侧, 以同样的方法取出另一侧卵巢。

1.3 脑组织处理去卵巢雌鼠经雌激素处理3 d后, 将大鼠断头, 参照Paxinos和Watson[4] 鼠脑立体定位图谱, 在冰台上迅速取出Amy和Str组织,将各组织准确称重, 加入样品预处理A液(即0.4 mol/L高氯酸溶液)后将组织匀浆, 经12000 r/min离心20 min, 取上清液加入预处理B 液(mmol/L:柠檬酸钾 20、 磷酸氢二钾 300、乙二胺四乙酸二钠 2), 再经12000 r/min离心20 min后, 取上清液置于－80℃低温冰箱贮存,待行色谱分析测定各样品组织的DA、 DOPAC和HVA的含量。

1.4 高效液相色谱测定实验应用日本岛津公司6 A系列高效液相色谱仪。流动相含(mmol/L): 柠檬酸63.5、 柠檬酸三钠 61、 乙二胺四乙酸二钠0.1、八烷基磺酸钠0.65和10%甲醇, pH 4.3, 流速1.2 ml/min, 设定工作电压0.8 V。取样品20 μl进样, 检测各样品DA、 DOPAC及HVA含量。实验用主要试剂DA、 dOPAC和HVA均为美国Sigma公司产品。

1.5 统计学处理各组数据均用mean±SE表示, 用t检验、 方差分析检测均数间的差异显著性。

2结果

2.1 雌激素对Amy的DA及其代谢产物含量变化的影响

与OVX组大鼠相比, 给予OVX大鼠皮下注射EB 10 μg/d 可引起大鼠Amy的DA及其代谢产物DOPAC、 HVA的含量分别减少56.4%、50%和54.5%(P＜0.05), 注射EB 20 μg/d后发现DA、 DOPAC和HVA的含量分别减少58.2%、43.8%和27.3%。正常大鼠及生理剂量组大鼠与OVX 组大鼠相比, Amy的DA及其代谢产物含量的差异均无统计学意义。

2.2 雌激素对Str的DA及其代谢产物含量的影响与OVX组大鼠相比, 给OVX大鼠应用生理剂量5 μg/d、 以及10、 20 μg/d剂量的EB可使Str的 DA分别降低13.4%、 14.8%、 14.2%, 各剂量组的DA代谢产物DOPAC和HVA的含量亦有下降趋势, 然而均无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 Amy与Str的DA组织含量及更新率的比较

研究表明, 正常雌鼠Str的DA组织含量(0.504±0.06 ng/mg)是Amy(0.079±0.017 ng/mg)的6.4倍。当给予OVX雌鼠注射大剂量EB(10、 20 μg/d)时, 由于Amy的DA组织含量减少, Str组织的DA含量分别是Amy的10.1倍和10.6倍。

比较Amy和Str的DA更新率发现, 正常大鼠Amy组织的DA更新率((DOPAC+HVA)/DA)明显高于Str组织,其DA更新率(0.782±0.108)约是Str(0.308±0.031)的2倍(P＜0.05)。给予OVX雌鼠注射不同剂量的EB后发现, 与OVX组雌鼠Amy更新率相比,各剂量雌激素处理组大鼠的Amy DA更新率均明显快于OVX组(P＜0.05), 接近正常雌鼠组; 而各组Str组织的DA更新率波动于0.253±0.045～0.315±0.022之间,各组更新率间的比较均无统计学意义。

3讨论

脑内的DA代谢是一个复杂的过程, 包括DA的合成、 释放、 代谢即降解和重摄取四个组成部分。我们的前期工作表明电刺激诱发的 Amy DA释放具有雌激素依赖性,并随着雌激素应用剂量的增加而释放增多[5]。本实验通过采用HPLC技术检测细胞内外DA及其代谢产物的总含量的结果表明, amy的DA组织含量因雌激素使用剂量的加大而减少, 此实验结果与我们以前的研究结果相符。因此, 我们先前关于雌激素对Amy dA释放的影响和本工作关于雌激素对Amy DA组织含量影响的综合性研究得出, 雌激素对Amy组织DA代谢有直接作用。有关于Str的研究认为,单从DA代谢的某一过程而言, 雌激素可以影响Str的DA代谢。例如， 有研究报道雌鼠Str组织的DA合成酶活性、 dA释放及DA受体密度和亲和力均表现出雌激素相关性[6]。然而我们的实验表明雌激素对Str组织DA含量的影响不明显。综上所述我们认为, 雌激素对Str的DA代谢不无作用,但就本工作而言尚不能确定雌激素引起的Str的DA组织含量变化是由于影响哪一具体过程所致。此外, 雌激素对Amy与 Str组织DA代谢的不同影响作用也提示, amy与Str的DA代谢过程或机制可能不同。

amy与Str均为富含DA的核团。边缘结构Amy的DA能神经纤维主要来自于腹侧背盖区和黑质, 其DA主要与情感、 运动以及认知机能有关,并参与下丘脑对垂体内分泌的控制与调节。Str是控制运动的一个重要调节中枢, 其DA主要来自于黑质内的DA能神经元。因此, Amy与Str的DA来源及功能均有其不同的特点。1994年, garris等[7]通过在体研究Amy和Str发现, Amy的细胞外DA代谢明显不同于Str, Amy的细胞外DA清除率约是Str的1/10。我们的实验从更新率的角度表明,正常雌鼠的Amy组织DA含量约是Str的1/6, 而Amy组织的DA更新率是Str的2倍左右。研究认为, DA 的重摄取是脑内DA代谢的主要途径[8],摄取速度决定DA的半衰期以及扩散距离[9]。我们认为Amy的DA更新率高于Str是因其清除率低于Str的缘故, Amy与Str组织DA代谢的差异可能与DA的组织清除率有关。

雌激素核内受体或膜受体的存在是雌激素作用的必要条件。自1986年雌激素受体(estrogen receptor, ER)成功克隆以来,人们已普遍接受仅有一种ER的观点。然而, 1996年另一种雌激素受体类型, 即雌激素受体β(estrogen receptor beta, ERβ)的发现[10]使雌激素作用机制的研究更为乐观,但也增加了雌激素受体研究的复杂性。有关两种受体在中枢神经系统的组织分布的研究发现, 边缘系统中存在大量ER, 主要是ERα[11], 而Str的ER数量较少,并且直到1992年才被发现[12]。然而, 1999年Kuppers等[13]研究发现, ER各亚型(ERα和ERβ)的mRNA在胚胎小鼠的纹状体含量较高,小鼠出生早期的含量仍保持在较高水平, 而成年后含量则较低, 并且ER的表达无性别差异。因此, 我们认为雌激素对黑质-纹状体和中脑边缘DA能神经系统的作用不同,其原因可能与雌激素受体的分布特征及数量有关。

总之, 雌激素对Amy与 Str DA能神经元功能的调节机制不同, 由此我们认为, Amy与 Str的DA在DA能神经元功能障碍性疾病如PD发病过程中的作用不同, PD发病的性别差异可能与雌激素影响Amy的DA代谢密切相关, 而Str对于PD的发病则有着更重要的意义[14]。关于雌激素作用的受体及其与DA关系的机制有待于进一步探讨。

参考文献

[1]Braak H, Braak E, Yilmazer D, de Vos RA, Jansen EN, Bohl J, Jellinger K. amygdala pathology in Parkinson′s disease. Acta Neuropathol, 1994, 88: 493~500.

[2]Xie JX (谢俊霞), Tang M (唐 明), Oertel WH, Earl CD. Sex differences in amygdaloid dopamine release following electrical stimulation of the ventral tegmental area: an in vivo voltammetric study. Chin J Physiol Sci, 1997, 13(1): 17~24.

[３]Diamond SG,Markham CH,Hoehn<