摘要：用离体兔心灌流、 窦房结细胞动作电位记录、膜片钳实验和放射免疫分析细胞内cAMP含量等方法, 研究不同周龄组兔心自律性变慢的心脏内源性因素。实验结果提示,离体心脏和窦房结标本在没有神经体液因素影响的情况下也有随周龄增长而自律性变慢的现象。进一步的实验提示, 这可能是由于窦房结细胞内cAMP含量下降,使起搏离子流If的阈电位向负方向移位, 造成窦房结细胞4期自动除极速率降低, 最后导致心率变慢。上述结果表明, 成长过程中的心率变慢, 除有神经体液因素影响外,窦房结细胞本身自律性的改变也起了一定作用。在心脏的发育过程中, 胎儿和新生儿的心率最高; 随着年龄的增加,心跳逐渐减慢。以往一般认为是迷走紧张性增高所致。关于心脏本身自律性的活动,特别是心脏起搏点窦房结细胞自律性的变化是否对心率变慢起一定作用未见报道。在窦房结标本的实验中, 已观察到交感神经递质使起搏离子流If的激活曲线朝正方向移位,导致心率加快; 迷走神经递质使If朝负方向移位, 导致心率减慢[1~3]。已经知道, 在心脏各种细胞中, 大都含有与自律性活动有关的If离子通道(窦房结、浦肯野纤维, 甚至心室肌[4])。而If的激活电位随组织远离窦房结而逐渐变负, 窦房结为-40~-60 mV, 浦肯野细胞为-70~-90 mV,心室肌为-110~-130 mV[5]。由同一基因表达的、 具有相同电生理特性的 If 起搏离子流在心脏的不同组织显示不同的阈电位给我们提示:是否窦房结细胞本身的If阈电位会随着心脏的发育向更负方向移位, 内源性地导致心率变慢; 由于If受cAMP的调控[6~8], 这种变化是否与随年龄的增长, 胞内cAMP含量改变等因素有关。

本实验运用没有神经和体液因素影响的家兔离体灌流心脏、酶解游离的窦房结细胞等观察不同周龄组心脏自律性搏动的变化, 并进一步通过窦房结细胞自律性动作电位的测定、 起搏离子流If在不同周龄组的变化及细胞内cAMP含量的检测,研究窦房结细胞本身电生理和生化因素的改变在出生后心率变慢的过程中是否起作用。

1材料和方法

1.1 离体兔心心率的变化及心率变异性(heart rate variability)的测定 离体组分为2、 4、 6、 8周的家兔, 每组6只。麻醉后取出兔心,行Langendorff灌流法。灌流的台氏液成分为(mmol/L): naCl 140、 KCl 5.4、 CaCl2 1.8、 MgCl2 1、 HEPES 5、 葡萄糖10, pH 7.4,通100%O2。待离体心脏跳动稳定后用自制的银丝电极固定贴附在心脏标本表面, 引导离体心脏的心电图。心电图信号经Adinstrument公司的Chart软件输入电脑,以澳大利亚AD公司HRVfor Macintosh进行心率及心率变异的分析[9]。

1.2 兔窦房结自律性动作电位的记录 制备窦房结标本[10],固定于恒温(35.5±0.5℃)、 恒流(3 ml/min)的标本槽内, 以台氏液灌流(成分同上)。待标本自律性活动稳定后, 用电阻 25 M佟⒛诔3 mol/L KCl的玻璃微电极作窦房结细胞内穿刺, 记录自律性动作电位。记录信号经MPA2000输入计算机进行采样和分析(第二军医大学生理学教研室提供)。

1.3 窦房结游离细胞的分离、 穿孔膜片钳(perforated patch)及起搏离子流If阈电位的测定 分别选2~3和8~9周的家兔, 击昏后迅速取出心脏置于36℃台氏液中, 制备窦房结标本,用胶原酶游离单个窦房结细胞备用[11,12]。为防止电流衰减影响实验结果的正确性, 我们采用Amphotericin b作穿孔膜片钳[11,13]。记录电极液成分为(mmol/L): 门冬氨酸钾130、 MgCl２ 2、 EGTA 11、 Na-HEPES 10、 CaCl２5、 Na2-ATP 2、 Na-GTP 0.1, pH 7.2。细胞灌流液为台氏液(成分同上)。实验在32℃中进行。穿孔膜片钳形成后,用连细胞的膜片钳方法记录全细胞电流。当把窦房结细胞从保持电位(Eh=-35 mV)超极化钳制到 -45、 -55、 -65、 -75、 -85、-95或-105 mV时, 可观察到If 电流[14]。记录信号输入Axopatch 1D放大器, 并以Axon公司的SCOPE软件进行采样、 储存和分析,测定起搏电流If在不同周龄组阈电位的变化。

1.4 放射免疫分析法(RIA)测量窦房结细胞cAMP含量[15] 实验动物分组为2、 4、 8和12周龄的家兔, 每组5只。如上所述制备窦房结标本, 立即浸入含0.5 ml hClO4的匀浆器中制成匀浆。匀浆经低温离心机(3000 r/min, 15 min)离心, 取其上清液滴加2 mol/LKOH中和至pH值为6,再次低温离心(3000 r/min, 15 min)后取其上清液放入0~4℃冰箱中备用(可保存一周)。测量时分别在每一加样管中加入前述0~4℃保存的各样本50靗 (并在空白组中加不同量的cAMP标准液,用以绘制cAMP浓度的标准曲线)、醋酸缓冲液(pH 4.75, 含EDTA4 mmol/L)50 靗、 3H-cAMP (15000 dpm/100 靗)100靗、 乙酰化试剂8靗和抗血清(1:20000) 100 靗。将各加样管摇匀后置于0~4℃冰箱中反应12 h, 次日用磷酸淋洗液冲洗加样管,并把冲洗后的淋洗液经微孔滤膜进行负压抽滤(300~500 mmHg)。为保持cAMP的活性, 上述全部操作在冰浴中进行。取下微孔滤膜片放入80℃恒温烘箱30 min, 再将膜片浸入含5 ml闪烁液的小管中, 用液体闪烁计数器作放射性cAMP测量。绘制cAMP浓度的标准曲线。最后根据标准液的放射性计数, 拟合标准曲线,并根据各加样管的放射性计数得出各窦房结标本的cAMP含量。

2 结果

2.1不同周龄兔离体心脏自律性心率及心率变异分析

2.2不同周龄组兔窦房结细胞动作电位参数的变化

结果显示, 随周龄的增大,窦房结的自律性活动由217次/min下降到89次/min (P＜0.05), 最大复极电位和阈电位均有随周龄增大而变负的趋势, 但两者的电位差距无显著性变化,而4期自动除极速率却随周龄增大明显减慢。表明在各电生理参数的变化中, 4期自动除极速率的变化对自律性的降低影响较大。

2.3 起搏离子流If阈电位的变化

记录家兔在测试电位(Ec)的各电流情况,以刚出现内向离子流的超极化测试电位为If阈电位。12只幼兔(2~3周)的平均If阈电位为 -46.7±3.3 mV。9只成年兔(8~9周)If的阈电位为-51.1±6.0 mV。两者有显著性差异(P＜0.05)。此结果表明大周龄组兔心窦房结起搏离子流的激活阈电位向负电位方向移位,这可能是造成4期自动除极速率变慢的原因之一。图2A为其中一例。

2.4不同周龄兔窦房结细胞cAMP的浓度

结果显示: 随周龄增长, 窦房结细胞cAMP浓度由0.31±0.048靘ol/L下降至成年兔的0.025±0.002靘ol/L,具有显著性的统计学意义(P＜0.05)。

3讨论

随着实验兔龄的逐渐增大,本文中离体灌流心脏自律性心率逐渐减慢及窦房结组织标本中细胞动作电位自律性降低, 均说明在没有神经体液因素的影响下, 心率也会随着年龄的增长而减慢,提示除神经体液因素外, 心源性因素在其中起一定作用。

窦房结是心脏的起搏点。我们选用窦房结组织细胞作电生理和生化测定,较易研究成长过程中心率变慢的心源性机制。在窦房结细胞动作电位记录中, 最大复极电位虽随周龄增大逐渐变负, 但自动除极的阈电位也有相应的变化,这样使最大复极电位和阈电位之间的差值并不改变很多, 但4期自动除极速率在2周幼兔为90 mV/s, 而成年兔为49 mV/s,呈明显下降。这从动作电位水平说明自律性降低的原因与4期自动除极速率变化有关。窦房结的起搏离子流众多[16],其中超极化激活的If离子流是起搏活动的重要因素之一[17]。本实验发现, 成年兔(8~9周)If在超极化激活时的阈电位明显负于幼年兔, 尽管这种阈电位的变化仅4 mV之差, 但由于窦房结细胞膜电阻很大[18], 跨膜电流的微小变化即可引起跨膜电位(自动除极)的较大改变。这可能是随周龄增大,细胞动作电位自动除极速率减慢的原因之一。溶液中加入可透过细胞膜的cAMP(结果2.3)后, If的阈电位向正电位方向移位, 这并非我们的发现[18],我们只是验证此实验。但给我们的启示是: 窦房结细胞内cAMP的含量是否会随周龄的增长, 有逐步下降的趋势？

本文用放射免疫分析法进一步测定了窦房结组织内cAMP在不同周龄组的含量。严格地说,是测定窦房结组织的cAMP含量, 因为我们只取了一块窦房结标本。为保证测量的正确性, 我们所取标本很小,尽量剔除周边的心房肌组织。实验结果显示了不同周龄组的窦房结所含cAMP有极明显的差异: 2周组为0.31 靘ol/L,随周龄增大逐步下降到0.025 靘ol/L,两者有12.5倍之差。2、 4、8和12周的窦房结细胞动作电位的4期自动除极速率和窦房结标本的cAMP含量相关性统计分析显示两者的相关系数(r)为0.93,两者的变化趋势一致。此结果表明If阈电位随周龄增加变负可能与cAMP含量有关, 这一点并不排除其它起搏离子流在自律性变化中可能起的作用。此外, cAMP含量变化的机制是什么,目前也不清楚, 还需作进一步的研究。

在膜片钳全细胞电流记录模式中,最易出现的问题是所测电流的衰减现象(run down)。本实验中运用Amphotericin B作穿孔膜片钳, 防止了run down现象的发生[11],这样可使If电流及阈电位测定的实验结果更可靠些。

动物和人在成长过程中心率变慢是一个普遍现象,成年人的心率变慢具有重要生理意义, 它使成年人机体具有更好的心率贮备。在此过程中, 神经体液因素起了很重要的作用,特别是迷走紧张性随年龄增加而增高是众所周知的。我们已在“用心率变异功率谱研究出生后心率变慢的机理”中进一步证实(论文已接受发表):成年兔心离体和在体的HRV功率谱图有明显差别。在体心脏的高频成分(反映迷走紧张)为2.68±1.23, 而离体心脏的高频成分为0,心率波动程度在各年龄组无显著性差异(见表1 SDNN)。在人体非损伤性测定中, 一周内新生儿、 4~5岁幼儿和10~12岁儿童的HRV的高频成分分别为119、873、<