摘要：应用免疫组化和免疫荧光双标技术结合激光共聚焦扫描显微镜, 观察缺血性脑损伤后脑内nestin的表达及其细胞类型。实验观察结果为, 再灌后1天,在缺血中心区可见nestin阳性突起; 再灌后3天和1周时, 除缺血中心区外, 周边Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区均有nestin大量表达; 而2周时仅限于周边Ⅰ区大量表达。激光共聚焦扫描显微镜观察到, 再灌后3天, 周边Ⅰ区nestin阳性突起主要与GFAP共存; 2周时, nestin阳性突起变粗、变长, 并与NSE的共存明显增多。上述研究结果提示,脑缺血可诱导大鼠脑缺血区域表达nestin, 该表达可能与神经细胞的修复有关。最早发现于胚胎鼠中央管有丝分裂细胞, 其一级结构中含有307个氨基酸组成的保守核心区, 该核心区氨基酸序列与已知的中间丝蛋白核心区相同,因其首尾结构与已发现的五种中间丝蛋白不同, 因此被确认为第六种中间丝蛋白[1,2]。Nestin在神经细胞中的表达起始于胚胎期, 当神经细胞迁移基本完成后,其表达开始下降, 并随细胞的成熟停止表达。 Nestin的功能目前尚不清楚, 因多出现于胚胎期神经细胞中, 推测与胚胎神经细胞的某些功能有关,如维持原始细胞特殊的形态、 参与细胞迁移等。由于nestin多出现于早期原始分化的细胞,目前已被广泛应用于神经干细胞的鉴定[1~3]。大量实验证实成年脑内海马齿状回和室管膜下区存在神经干细胞。生长因子、 学习记忆、应激[4~7]等生理条件以及机械性损伤、 癫痫、 缺血[8~11]等病理条件, 均可影响神经干细胞增殖和分化。近来有人提出大脑皮层存在神经干细胞,神经元坏死可诱导这些神经干细胞分化为神经元和胶质细胞[12,13]; 也有人提出缺血性脑损伤不仅可诱导海马齿状回的神经元再生,而且还可诱导大脑皮层中已分化神经细胞再表达胚胎期蛋白[14] 。这就提示, 在特定的条件下, 成年脑中静止的神经干细胞可恢复其增殖分化能力,而成熟的神经细胞也可返回到幼稚状态, 表达发育期的蛋白, 这些都可能在缺血后的修复过程中发挥重要作用[14]。然而,在局灶性脑缺血情况下脑内不同区域该蛋白的表达尚未见报道。本研究着重分析缺血性脑损伤后脑内不同区域nestin表达及nestin阳性细胞的细胞类型。

1 材料和方法

1.1 大脑中动脉栓塞再灌注模型(MCAO)制备 健康雄性Sprague-Dawley大鼠(220~250 g, 清洁级,由复旦大学上海医学院实验动物中心提供), 按0.36 ml/100 g体重剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉。参照Longa方法[15]行左侧MCAO手术。以4~0号尼龙手术线(头端圆钝)阻断大脑中动脉,1 h后缓慢退出尼龙线实施再灌注。手术期间检测血气, 肛温维持在37±0.5℃。选取血气分析在正常范围内(pH：7.25~7.38; PO2: 84~92 mmHg; PCO2: 42~56 mmHg)的动物进行模型制备, 并分别于再灌后3、 6小时, 1、 3天, 1、2周处死(每个时间点n=5)。术后出现步态不稳或右前肢瘫痪者用于实验。单纯手术而未插线动物作为假手术对照组(n=5)。

1.2 冰冻组织切片制备 动物麻醉后, 经左心室灌注生理盐水和4%多聚甲醛, 取脑。在4℃条件下, 脑组织经4%多聚甲醛后固定6 h,依次浸于20%和30%蔗糖液, 待脑组织下沉行冠状面冰冻切片(厚30 μm)。选取Bregma 0.48~0.26 mm 断面脑片备用。

1.3 组织化学法 脑片分为3组。第1组用常规焦油紫染色, 以分析脑损伤的范围及程度。第2组取脑片与鼠抗nestin抗体(1:5000, 加拿大Pharmingen公司)4℃ 孵育过夜, 采用ABC法行nestin 免疫组织化学染色, 行DAB显色, 常规脱水、 透明, 中性树胶封片。用抗体稀释液替代nestin抗体处理脑片作阴性对照。第3组行免疫荧光组织化学双重标记,选取再灌后3天和2周的脑片经nestin 抗体孵育, 抗鼠IgG-FITC(1:20, 德国罗氏公司)37℃ 孵育1 h后分别用兔抗NSE抗体 (1:100,美国ICN. 公司) 和鼠抗GFAP抗体(1:100, 丹麦 DAKO公司) 4℃ 孵育过夜, 再分别用抗兔和抗鼠IgG-罗达明(1:20,德国罗氏公司)37℃孵育1 h, 贴片后立即封片。用Leica激光共聚焦扫描显微镜观察免疫荧光双标结果。

1.4 统计 所有数据均用mean±SED表示。多组数据间比较采用单因素方差分析( one-way ANOVA)结合SNK检验。两组间比较采用非配对t检验。P＜0.05为差别有显著性统计学意义。

2 结果大鼠经左侧大脑中动脉栓塞再灌注, 苏醒后出现左侧Horner征和右侧前肢瘫痪。术中, 体温、血气正常。焦油紫染色显示缺血侧大脑半球着色明显变淡,尾壳核外侧部神经元缩小变形,可见核溶解、 核碎裂、 核固缩, 梗死灶明显。随着动物存活时间的延长,梗死灶逐渐扩大并累及顶叶皮层, 再灌1周后梗死灶不再扩大。出现梗死灶的区域, 包括尾壳核外侧部和部分顶叶皮层,即为缺血中心区。缺血周边区受损神经元呈现细胞肿胀, 尼氏体消失等神经元变性的特征,而缺血对侧大脑半球的神经元形态无明显异常。

nestin免疫组化研究观察到, 对照组和缺血对侧大脑半球nestin阳性物质主要分布于血管、 脑膜下、 脉络丛上皮细胞、 室管膜上皮细胞和室管膜下区,在扣带皮层、 隔核和斜角带也可见到nestin阳性细胞(图1)。缺血性损伤后, nestin阳性物质除分布于上述部位外, 在缺血区域,随着缺血中心区的逐渐扩大, nestin的表达也随之增高。我们观察了缺血中心区周边的顶叶皮层(cortex A)、 额叶皮层(cortex b)及扣带皮层(cortex C),并依次命名为缺血周边Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ区。缺血周边Ⅰ区位于严重缺血中心区周围的低灌区, 由周边Ⅰ区到周边Ⅲ区,其缺血程度逐渐减弱。在再灌后1天, 大脑中动脉供血区(包括纹状体及大脑皮层)可见nestin阳性突起, 但没有形成明显的界限。在缺血周边Ⅰ区,再灌后3天时粗大的nestin阳性突起伸向缺血中心区并围绕中心区形成明显的界限; 2周时, nestin阳性突起变得清晰而纤细。在缺血周边Ⅱ、 Ⅲ区,再灌后3天和1周可见nestin阳性突起; 2周时nestin阳性突起减少。 用Leica Q500IW图像处理系统分析单位面积nestin 积分光密度值(IOD/μm2)的变化。

统计分析显示, 在缺血周边 Ⅰ区, 再灌后1天, nestin表达明显高于对照组(P＜0.05),并持续到再灌后2周; 在缺血周边Ⅱ、 Ⅲ区, 再灌后3天, nestin表达明显增高(P＜0.05), 2周时恢复到对照水平。

尽管nestin在皮层和纹状体的表达仅局限于缺血侧, 但在胼胝体的表达是双侧的。 再灌后1天, 双侧胼胝体可见具有长突起的nestin阳性细胞,这些细胞的突起沿着白质纤维束平行排列, 3天后nestin阳性细胞明显增多。

为鉴别缺血诱导的nestin阳性细胞的细胞类型,我们用激光共聚焦扫描显微镜观察了再灌后3天和2周时缺血周边Ⅰ区免疫荧光双标的阳性反应信号。结果观察到,再灌后3天, 大部分nestin阳性突起与GFAP共存, 并具有星形胶质细胞的形态, 少量与NSE共存; 2周时, nestin阳性突起变粗大, 与NSE的共存明显增多。

3 讨论本文采用大脑中动脉栓塞再灌注(MCAO)模型, 探讨了成年鼠缺血性损伤后脑内中间丝蛋白nestin的变化。 正常情况下, nestin阳性物质主要分布于血管、脑膜下、 脉络丛和室管膜上皮细胞以及室管膜下区, 这种分布与文献报道一致[16]。 缺血损伤后, nestin表达明显增加, 除上述区域外, 在缺血中心区和周边区均有表达。 从诱导表达的时程来看, 在缺血周边Ⅰ区, 再灌后1天, nestin表达明显增高并持续到2周; 在缺血周边Ⅱ、 Ⅲ区, 再灌后3天, nestin表达明显增高, 2周时恢复到对照水平。 这一表达模式与脑缺血后诱导GFAP的变化相似[17,18]。nestin免疫组化结果可见其阳性细胞的外形与星形胶质细胞相似。文献报道, 脑损伤后反应性星形胶质细胞不仅表达GFAP, 同时也表达vimentin和nestin[19]。有人认为损伤周围nestin表达上调是检测星形胶质细胞反应的敏感指标[20]。本实验荧光双标也观察到缺血后部分nestin阳性细胞与GFAP(星形胶质细胞的标记)共存, 由此进一步证实脑缺血可诱导反应性星形胶质细胞表达nestin蛋白。从区域来看, 在缺血周边Ⅰ区, 再灌后3天, 粗大的nestin阳性突起伸向缺血中心区, 围绕缺血中心区形成明显的界限, 2周时nestin突起变得清晰而纤细;在缺血周边Ⅱ、 Ⅲ区, 再灌后3天和1周可见nestin阳性突起, 2周时nestin突起减少。 激光共聚焦显微镜分析可见, 再灌后3天 nestin阳性细胞呈星状,大多数与GFAP共存, 2周时这种共存现象仅局限于与梗死灶交界处, 并且nestin阳性细胞突起变长、 变粗。 文献报道脑缺血后星形胶质细胞中间丝蛋白GFAP的变化与星形胶质细胞的生存环境有关[17]。结合nestin的表达时程,我们推测, 脑缺血诱导nestin表达的机制可能类似于诱导GFAP表达的机制[17]。 再灌后3天, 缺血周边Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ区均有nestin的表达,该表达可能是胶质细胞对缺血的直接反应, 也可能是胶质细胞对环境变化, 如细胞因子、 生长因子、 细胞外离子和氨基酸改变的继发反应; 再灌后2周, nestin表达趋向于局限化,仅分布在缺血周边Ⅰ区, 这可能与血管增生、 组织裂解产物、 白细胞侵入或持续性缺乏神经元的营养因子有关[17]。 这种缺血后脑内不同区域nestin表达变化不一,也反映了nestin表达可能与缺血程度有关。缺血周边Ⅰ区nestin的长期表达可能是神经细胞抵御缺血性损伤的继发性保护反应。

本研究还观察到, 缺血脑内nestin阳性细胞有NSE表达。体外培养证实nestin与NSE共存的细胞提示神经干细胞向神经元方向分化[3,21]。本实验结果发现,再灌后3天突起短的nestin阳性细胞表达NSE, 再灌后2周长突起nestin阳性细胞也表达NSE。这类细胞的细胞形态与反应性星形胶质细胞极为相似,而无明显的神经元的形态特征。Schinstine 和Iacovitti[22]报告, 神经干细胞分化为星形胶质细胞后, 短期内仍然保留神经元的特征,从而推测损伤后表达神经元表型的反应性胶质细胞可能来源于神经干细胞。另外, 成年动物脑内神经元本身也可以抑制胶质细胞表达神经元抗原,故胶质细胞表达神经元表型可能与神经元受损后解除<