摘要：为了解成年大鼠海马CA1区锥体细胞KATP通道的特性, 实验采用膜片钳技术的内面向外式记录法, 在急性分离的CA1区锥体神经元上,研究了可被胞浆侧ATP所抑制的钾离子单通道的特性。当细胞膜内外两侧的K+浓度均为140 mmol/L时, 通道的电导为63 pS, 翻转电位为1.71 mV,通道呈弱内向整流性。在负钳制电位时, 通道开放时常被短时程的关闭所打断, 而在正钳制电位时,这种短时程的关闭状态明显少于负钳制电位时。但通道开放概率未见明显的电压依赖性。ATP对通道活动的抑制作用呈浓度依赖性, 抑制通道活动50%的ATP浓度为0.1 mmol/L。KATP通道的特异性阻断剂tolbutamide (甲糖宁, 1 mmol/L)可完全阻断通道的活动, 而KATP通道开放剂diazoxide(二氮嗪, 1 mmol/L)则不增强通道的活动。KATP通道的生理和病理作用在胰β细胞已被研究得较为透彻。但到目前为止, 对中枢神经系统KATP通道的生理作用还知之甚少。许多学者认为, KATP通道将神经细胞的新陈代谢与兴奋性联系起来,很可能在脑缺血缺氧等病理情况下起重要作用。近年来, 有一些文章报道在脑的许多结构如大脑皮层［1,2］、 下丘脑［3］、海马［2,4,5］等存在KATP通道,但由于所采用细胞的发育水平不同和所用的记录方式不同, 所报道的KATP通道在激活条件、 单通道电导、 通道的整流特性、药物作用等方面存在着很大的差异。迄今为止,对海马KATP通道的单通道研究很少, 而且是在培养的神经元上进行的［4］, 没有精确区分海马的亚区和海马神经元的类型, 对成年动物海马CA1区锥体神经元 kATP通道的单通道特性尚未见报5期周英杰等: 成年大鼠海马CA1区锥体细胞KATP ?通道的特性生理学报 Acta Physiol. Sin.53卷未见报道。由于神经系统的KATP通道的功能被认为主要与缺血缺氧时神经元的损伤与保护作用有关［6］,而海马CA1区锥体神经元对缺血的敏感性又高于其它区的神经元［7］, 所以要阐明缺血后CA1锥体神经元损伤的机制, 有必要首先对这些神经元的KATP通道有一个较清楚的认识。为此,本文采用急性分离的成年大鼠海马CA1区锥体神经元, 对KATP通道的单通道特性进行了系统的研究。

1材料和方法

１.1 脑片的制备与神经元的急性分离［8］成年Wistar大鼠(200~250 g)麻醉后(水合氯醛40mg/100 g)迅速断头取脑,置于0~4℃的高浓度蔗糖溶液中冷冻约2 min, 再用振动切片机(World Precision Instruments MA752-045)切成400 μm厚的脑片。高浓度蔗糖溶液的成分为(mmol/L):蔗糖 234、 KCl 2.5、 Na2HPO4 1、 MgSO4 4、 CaCl2 0.1、 HEPES 15、 葡萄糖 11、 用1 mol/L的NaOH调pH值至7.3。将切好的脑片置于通以95% o2+5% CO2混合气的EBSS液中孵育1~6 h (室温), 然后将脑片移入低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中, 并在解剖显微镜下用细解剖针按Paxinos图谱所示,将海马CA1区含锥体细胞层的一小块组织从脑片上分割下来, 将组织块放入用100% O2饱和的HBSS液中(33℃)用链白蛋白酶(protease XIV,1.1~1.4 mg/ml)消化30~45 min后取出, 置于低Ca2+的羟乙基磺酸钠缓冲液中清洗3次, 用尖端经火抛光处理的吸管(口径依次为500、300和150 μm)将之吹打成细胞悬液, 并移数滴至盖玻片上。待细胞贴壁后, 先将盖玻片用浴槽液清洗两遍,再移至浴槽内进行实验。实验仅选用形态为锥形或梭形、有顶树突和基树突特征的锥体细胞进行记录。

1.2 通道电流记录与数据分析采用膜片钳技术的内面向外式方法记录单通道电流。通过倒置显微镜(Olympic IX70)的观察, 用微电极操纵器(Ｎarishige mO-203, 日本)驱动微电极接近锥体细胞, 在微电极尖端刚与细胞膜接触时稍加负压形成高阻密封(封接电阻大于５ GΩ)。玻璃微电极尖端直径约１ μm,内灌电极液后电阻为8~12 ＭΩ, 内插乏极化氯化银电极与膜片钳放大器(CEZ-2300型, 日本光电公司)相连, 放大器探头反馈电阻为50ＧΩ,低通滤波器滤波频率为3 kHz。单通道电流经DMA数据采集系统(Labmaster-125 kHz, 美国Axon公司)用Pclamp (5.5.1版 axon)软件的FETCHEX程序采集入计算机, 用FETCHAN程序进行测量, 测量结果用pSTAT程序进行通道电流幅度、开放概率、 开放时间、关闭时间等统计学处理。采样频率为5 kHz, 测量通道开关事件的时间分辨率为300 μs。全部数据以mean±SD差表示, 两组间的比较采用t检验,多组间的比较采用方差分析(ANOVA)进行统计学处理, P＜0.05表示具有显著性意义。

1.3 实验步骤及所用药品和溶液在高阻封接形成后提起微电极, 形成内面向外式。由膜片钳放大器在±60 mV范围内输出钳制电压, 观察通道电流活动;分别加入不同浓度的ATP于浴槽中, 作出ATP抑制通道活动的抑制浓度曲线; 观察甲糖宁、 二氮嗪对KATP通道活动的影响。浴槽液成分(mmol/L): KCl140、 HEPES 10、 EGTA 2, 用1 mmol/L的KOH将pH值调至7.3。微电极内液的成分(mmol/L): KCl 140、 CaCl21、 MgCl2 0.5、 HEPES 10, 用1 mmol/L的KOH调pH值调至7.3。ATP用浴槽液配制成1 mol/L的母液; tolbutamide和diazoxide均溶解于0.15 mol/L的NaOH溶液中配制成1 mol/L的母液, 并用HCl将溶液pH值调至7.4,实验时取各药品的母液适量加入浴槽液(1 ml)中形成终浓度。所有液体均在4℃冰箱保存, 实验前取出复温, 用前以混合纤维素酯微孔滤膜(孔径0.22 μm)过滤待用。单通道记录时环境温度为22~24℃。实验中所用的链白蛋白酶、 aTP、 甲糖宁、 二氮嗪、 HEPES、 EGTA均购自Sigma公司, 其余试剂购自国内制剂公司。

2结果

2.1 单通道电流及电导

在约400个细胞的内面向外式记录膜片上, 记录到36例能被ATP和tolbutamide所阻断的单通道电流。在膜片被撕脱下来形成内面向外式后即可记录到通道活动,通道开放多呈簇状(cluster openings)和猝发样(burst opening), 两次开放之间常为较长时间的关闭状态。在所记录的36例通道中,有5例呈二级开放, 其余均呈一级开放状态。在实验记录时间内未见通道有明显的时间依赖性失活。通道电流的幅度随超极化或去极化程度加大而增大, 在同一钳制电位下,通道电流幅度基本相同, 呈波宽不等的矩形方波, 其幅度分布直方图呈对称的单峰状, 并能很好地进行高斯拟合。当钳制电位为负时, 电流-电压(I-V)曲线为直线;钳制电位为正时, 则为电流幅度较钳制电位为负时略有减小的曲线, 表明通道呈弱的内向整流性。在0~－60mV之间, 单通道的电导为62.57±6.29 pS(n=26),翻转电位为1.71±0.64 mV(n=8)。

2.2 通道的动力学特性

如图1A所示, 在负钳制电位时, 通道开放时常被短时程的关闭所打断; 而正钳制电位时, 这种短时程的关闭状态明显较负钳制电位时少,所以负钳制电位时通道的开放频率较正钳制电位时高(表1)。通道的开放和关闭时间分布直方图均呈指数分布,可进行二级指数拟合。表1是钳制电位为+40mV或－40mV时通道的开放和关闭时间常数及开放频率的统计结果。分析关闭时间常数发现,与上述的负钳制电位时通道开放中有较多的短时程关闭一致, 负钳制电位时, 关闭时间常数的长成分τC2明显小于正钳制电位时的长成分τC2(表1),短成分τC1虽与正钳制电位时无明显差别, 但在总关闭时间中所占的比例较大, 如V=－40mV时短成分τC1占(57±8)%,而V=+40mV时短成分占(33±12)%, 两者相比有显著差异(n=9, P＜0.05)。从开放时间看,负钳制电位时开放时间常数的长成分τ02明显小于正钳制电位时的τ02, 这也是由于负钳制电位时通道的开放中有许多短时程关闭的缘故。

2.3 通道的电压依赖性

对14例在不同细胞上记录到的KATP通道在钳制电位分别为±40mV和±60mV时通道的开放概率进行统计, 结果表明不同钳制电位时通道的开放概率无显著差异(P＞0.05 ANOVA), 说明通道的开放概率没有电压依赖性。 但通过分析通道的动力学特性可见, 负钳制电位时,通道的开放和关闭时间常数的长成分均较正钳制电位时的短, 并且关闭时间常数的短成分在总关闭时间中所占的比例也大于正钳制电位时的。 因此, 表明KATP通道的时间动力学特性有明显的电压依赖性。

2.4 通道对ATP的敏感性

在不同的钳制电位下, 通道的活动均可被加入浴槽中膜胞浆侧的不同浓度的ATP所抑制, 这种抑制作用主要是减少通道的开放概率, 对通道的电流幅度没有影响。 ATP对通道的抑制作用呈浓度依赖性, 1 mmol/L的ATP就能完全阻断所有钳制电压下通道电流的活动。 以钳制电位为 －40 mV 时为例,作出不同浓度的ATP对通道活动抑制作用的量-效曲线, 根据拟合方程得出ATP对通道抑制作用的IC50 (半数最大抑制浓度)约为0.1 mmol/L。

2.5 阻断剂和开放剂对KATP通道的作用

实验还观察了KATP通道的特异性阻断剂tolbutamide和开放剂diazoxide的影响。对5例不同膜片上的KATP通道进行一般的通道特性的分析后,在浴槽中加入1 mmol/L的tolbutamide, 10 min内KATP通道的活动被完全阻断。对3例KATP通道在浴槽中加入1 mmol/L的diazoxide,在接下来10~30 min内观察通道的活动, 未发现明显变化。

3讨论

由于内面向外式膜片的内外K+浓度相等, 其K+平衡电位应为0 mV, 与实验所记录到的通道翻转电位1.71 mV基本一致, 表明通道选择性地通透K+;电极液和浴槽液均不含Na+, 并用EGTA络合浴槽液中的Ca2+, 排除了记录到钠和钙离子通道以及钙激活的钾离子通道的可能性,而氯离子通道电导远大于本实验中所得的63 pS, 故实验中所记录到的电流应为K+通道电流; 该电流能被ATP和tolbutamide所阻断, 因此可确定该通道为KATP通道。

本文结果直接证明了在成年哺乳动物海马CA1锥体神经元上KATP通道的存在。所记录的KATP通道的单通道电导、弱的内向整