摘要：为研究白介素-2 (interleukin-2, IL-2)对心肌细胞内钙浓度(［Ca2+］i) 的影响及其信号转导途径,实验采用酶解法分离成年大鼠心室肌细胞, 以Fura2/AM为钙探针, 用细胞内双波长钙荧光系统检测细胞［Ca2+］i的变化。结果发现: (1) IL-2(0.5～200 U/ml)浓度依赖性地降低单个心室肌细胞内钙瞬态, IL-2 (200 U/ml) 对咖啡因诱导的肌浆网内储钙的释放无影响; (2) 纳洛酮(naloxone, nal) (10－８ mol/L) 和norbinaltorphimine (norBNI, 10－８ mol/L)可阻断IL2对心肌细胞钙瞬态的作用,而纳曲吲哚(naltrindole, NTI) (10－６ mol/L) 不能阻断此作用; (3) κ阿片受体激动剂U50488H (10－６ mol/L)降低心肌细胞钙瞬态, norBNI (10－８ mol/L)可阻断此作用; (4) 5 mg/L百日咳毒素(PTX)预处理可取消IL2降低心肌细胞钙瞬态的作用,而酪氨酸激酶抑制剂genistein (10－４ mol/L) 不能取消IL2的作用; (5) U73122预处理可阻断IL2的作用。研究结果表明, iL2降低心肌细胞钙瞬态的作用, 是通过心肌细胞上κ阿片受体介导的, 其下游途径包括PTX敏感的G蛋白和磷脂酶C。细胞因子是小分子多肽物质, 具有调节细胞的生长分化和免疫、参与炎症发生等功能。 最近的研究表明,细胞因子可通过多种机制对心血管系统的功能发挥调节作用［1,2］。白介素-2 (interleukin-2, IL-2)是机体复杂免疫网络中起调节作用的重要细胞因子之一, 已有研究证实心脏也是IL-2作用的靶器官, 但对IL-2在心脏作用的研究尚不深入。Finkel等［3］发现,在心室乳头肌模型上IL-2具有负性肌力作用; 而在离体大鼠心房标本上［4］, iL-2可通过促进儿茶酚胺类物质的释放激活β肾上腺素受体而产生正性肌力作用。在心肌外组织细胞上的研究提示, IL-2的作用可能与阿片系统有关。在PHA刺激的人淋巴细胞上,阿片受体阻断剂naloxone可阻断IL-2的作用［5］; 亦有研究报道, IL-2具有的中枢镇痛作用的机制可能与其激活脑内阿片受体有关［6］。基于此,本实验选用成年SpragueDawley大鼠酶解分离心室肌细胞, 以细胞内双波长钙荧光系统检测技术,研究IL-2对大鼠心肌细胞［Ca2+］i的影响,探讨IL-2的心脏作用与心肌阿片受体及其信号转导系统的关系。

1材料和方法

1.1 药品与溶液Ⅰ型胶原酶, 牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA), 纳洛酮(naloxone, Nal), norbinaltorphimine(norBNI), 纳曲吲哚(naltrindole, NTI), 3(N吗啡啉)丙磺酸［3(Nmorpholino) propanesulfonic acid, MOPS］, 咖啡因(caffeine), 百日咳毒素(pertussis toxin, PTX), genistein, U73122, u73343, U50488H均购自Sigma公司, IL-2购自上海华新生物高技术有限公司。

无钙Tyrode氏液成分(10－３ mol/L): NaCl 100.0、 KCl 10.0、 KH2PO4 1.2、 MgSO4 5.0、 葡萄糖 20.0、牛磺酸10.0、 MOPS 10.0 (pH 7.2)。

krebsHenseleit (KH)液成分(10－３ mol/L): NaCl 118.0、 KCl 4.7、 KH2PO4 1.2、 MgSO41.2、 NaHCO3 25.0、 CaCl2 1.25、 葡萄糖10.0 (pH 7.4)。

1.2 心室肌细胞酶解分离实验用酶解法分离心室肌细胞［7］。大鼠(240±10 g), 雌雄不拘, 用断头器处死后, 迅速打开胸腔, 取出心脏。 置于4℃氧饱和Tyrode氏液中洗净血液后移入盛有4℃氧饱和Tyrode氏液的培养皿中,游离主动脉根部, 插入主动脉套管, 然后固定于Langendorff灌流装置上进行恒流灌流, 灌流液温度37℃, 流速10 ml/min, 并以95％ o2＋5％ CO2饱和。先以无钙Tyrode氏液灌流5 min, 再以含I型胶原酶0.3 g/L的无钙Tyrode氏液灌流10 min,所用溶液均为临用时现配。将心脏从Langendorff灌流装置上取下, 剪去心房和基底部组织, 然后将心室肌剪碎, 并用广口吸管缓慢吹打, 于含0.1% BSA的无钙Tyrode氏液中37℃孵育15 min。得到的细胞悬液用200 μm的尼龙网过滤。滤液在无钙Tyrode氏液中逐步复钙至Ca2+浓度为1.25×10－６ mol/L。获得的细胞在室温下静置1～2 h后备用。

1.3 细胞内游离钙的测定用细胞内双波长钙荧光系统(T.I.L.L., 德国)检测细胞内游离钙离子浓度, 以Fura2/AM为钙指示剂。细胞稳定1～2 h后,用10－６ mol/L的Fura2/AM室温下负载30 min, 负载后的细胞用含1% BSA的KH液以500 r/min离心去除负载液并洗涤3次,将细胞悬液(100 μl)加在浴槽中待细胞贴壁, 以95％ O2＋5％ CO2饱和的KH液持续灌流。在灌流槽中通过片状铂电极施加频率为0.2 Hz、强度为50 V的电场刺激诱导细胞兴奋(特别指出的除外), 在电刺激下产生的细胞内钙离子浓度变化峰值为钙瞬态。选择合适细胞, 调节采样框大小,使非细胞区与细胞区比例达最小值。光信号通过T.I.L.L.放大器经Digidata 1200输入计算机, 由pClamp7.0软件记录分析。荧光激发波长分别为340和380 nm, 发射波长510 nm, 其荧光比值可反映细胞内钙离子浓度［8］。

1.4 实验分组及处理空白对照组(n=8): 对心肌细胞不作任何处理, 连续观察30 min。

iL2对钙瞬态作用组、 IL2剂量效应组(n=10): 灌流液中IL2浓度分别为0.5、 2.5、 10、 50、 200 U/ml, 实验观察时间为25 min; 热失活IL2组(n=10): IL2于70℃水浴中加热1 h以灭活其生物活性, 一次加入后使灌流液中IL2浓度达200 U/ml, 观察其效应。

iL2对肌浆网内储钙释放作用组: 咖啡因组(n=10): 对心肌细胞不作任何处理, 细胞稳定5 min后, 电刺激条件下记录10 min, 然后停止刺激15 s,再加入咖啡因(2×10－３ mol/L)［9］; IL2+咖啡因组(n=12): 细胞稳定后, 电刺激条件下记录5 min, 然后加入200 U/ml iL2作用5 min, 停止刺激15 s后加咖啡因。

1.5 统计学处理所有数据均以means±SD表示, 采用t检验, ANOVA和NewmanKeuls法进行显著性检验, P＜0.05差异有显著性。

2结果

2.1 白介素2对心肌细胞钙瞬态的作用

图2显示, IL2可降低电刺激诱导的心肌细胞钙瞬态值。2.5～200 U/ml显著降低心肌细胞钙瞬态值,且随浓度增加对心肌细胞钙瞬态值的降低作用增强。空白对照组无任何处理的心肌细胞其钙瞬态值随观察时间的延长无明显变化, 0 min时340/380 nm比值为0.97±0.05, 以KH灌流30 min后为0.95±0.07 (P＞0.05)。200 U/ml热失活IL2作用15 min后对心肌细胞钙瞬态值(处理vs处理前, 0.98±0.06 vs 0.99±0.05) 无显著影响(P＞0.05)。

2.2 白介素2对咖啡因诱导的内储Ca2+释放的作用

为探讨IL2对肌浆网内储Ca2+释放的作用, 我们观察了IL2对咖啡因诱导的肌浆网内储Ca2+释放的影响。图3所示为空白对照组和IL2 (200 u/ml)组对咖啡因诱导肌浆网内储Ca2+释放的影响。对照组细胞, 暴露于咖啡因后诱发的［Ca2+］i是电刺激诱导的钙瞬态值的101.23%, 与对照相比, iL-2 (200 U/ml)对咖啡因诱导内储钙的释放没有明显影响(P＞0.05)。

2.3 阿片受体拮抗剂对IL2作用的影响

为研究IL-2的作用是否与阿片受体有关, 分别用非选择性阿片受体拮抗剂Nal (10－８ mol/L) 或选择性κ阿片受体阻断剂norBNI (10－８ mol/L) 或选择性δ阿片受体阻断剂NTI (10－６ mol/L) 预处理心肌细胞10 min［10, 11］, 再观察IL-2的作用。图4结果表明, nal、 norBNI预处理阻断了IL-2 (200 U/ml)对心肌细胞钙瞬态值的作用, 而NTI不能阻断IL-2的作用。Nal、 norBNI和NTI单独作用,其自身对心室肌细胞钙瞬态值均无显著影响(P＞0.05)。

κ阿片受体激动剂U50488H (10－６ mol/L) 显著降低心肌细胞钙瞬态值, 用选择性κ阿片受体拮抗剂norBNI (10－６ mol/L)预处理细胞后, 取消了U50488H对钙瞬态值的降低作用。

2.4 百日咳毒素、 genistein 及U73122对IL-2降低细胞钙瞬态作用的影响

依照Xie等［12］的方法, 心肌细胞用5 mg/L PTX预处理1 h, 使PTX敏感的G蛋白失活后, 再加IL2观察其作用。

预处理后, 取消了IL2 (200 U/ml)对钙瞬态值的降低作用; 而用酪氨酸激酶抑制剂genistein (10－４ mol/L)预处理30 min后,抑制了酪氨酸激酶活性［13］, 但不能取消IL-2的作用。心肌细胞用PTX预处理1 h或用 genistein 预处理 30 min后,对心室肌细胞钙瞬态值无显著影响。

心肌细胞分别用磷脂酶C (phospholipase C, PLC) 抑制剂U73122 (5×10－６ mol/L) 预处理30 min以抑制其活性［14］,加IL-2 200 U/ml观察其作用。图6结果表明, 心肌细胞用U73122预处理30 min后, 可阻断IL2降低心室肌细胞钙瞬态的作用(vs iL-2组, P＜0.05), 而用其无活性结构类似物U73343 (5×10－６ mol/L)预处理心肌细胞30 min后,不能阻断IL2的作用。单用U73122和U73343预处理心肌细胞30 min, 对心室肌细胞钙瞬态值均无显著影响(P＞0.05)。

3讨论

在神经系统阿片类物质与细胞因子之间存在复杂的交互作用。药理学实验证实, 阿片受体有κ、 μ和δ三个亚型,而心肌细胞膜上存在着κ和δ受体的结合位点［15］。在鼠脑中, IL-2能够竞争性抑制阿片受体广谱配体及选择性μ、 δ和κ亚型配体与阿片受体的特异性结合,竞争性抑制作用呈浓度依赖关系［16］。已有研究表明, IL-2的中枢镇痛作用是通过阿片受体介导的［6］。本实验中, 非选择性阿片受体拮抗剂Nal (10－８ mol/L) 可有效阻断IL2对心肌细胞钙瞬态值的降低作用, 用特异性κ阿片受体拮抗剂norBNI (10－８ mol/L) 处理心肌细胞后,也可取消IL2的作用, 而特异性δ阿<