摘要：为探讨细胞内丝裂素原活化蛋白激酶(MAPK)家族各亚类信号转导通路在炎症性细胞因子白介素-1β (IL-1β )对大鼠肾系膜细胞(rMC)表型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达及其分布中的调控作用,以IL-1β (10 ng/ml)刺激体外培养的rMC, 用电穿孔基因转染及免疫杂交法观察IL-1β 对α-SMA基因启动子活性及蛋白表达的作用,并用共聚焦荧光显微镜及透射电镜观察IL-1β 刺激前后细胞内α-SMA及微丝的分布变化。通过应用PD98059和SB203580特异阻断ERK和 p38通路、共转染显性失活JNKK基因特异阻断JNK通路, 观察阻断对IL-1β 刺激所致α-SMA表达或启动子活性的影响。结果显示, IL-1β 刺激6 h可明显上调α-SMA启动子活性, 在1~2 d内显著促进其蛋白合成; IL-1β 刺激24 h后, 细胞内α-SMA及微丝在细胞核周的分布增加。阻断ERK通路对IL-1β诱导的α-SMA表达无明显影响; 阻断JNK及p38通路均可使IL-1β 诱导的α-SMA表达明显受抑; 阻断p38通路的作用比阻断JNK通路更强,而且对基础状态的α-SMA表达也有抑制作用。上述结果提示, IL-1β 可刺激rMC发生表型转化, 其表型标志物α-SMA可通过基因转录增强而增加蛋白表达,在细胞内的分布向核周转位积聚。JNK及p38通路是介导IL-1β 刺激rMC α-SMA表达的主要信号转导途径, 而ERK通路不影响IL-1β 的这一作用。系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)是我国最为常见的免疫介导性肾小球疾病。免疫损伤可使肾小球局部浸润的炎症细胞释放多种炎症介质,刺激并活化肾小球系膜细胞(MC), 使之从正常的静止表型转化为增殖/分泌表型。表型转化的MC可异常增殖, 表达细胞骨架蛋白或胚胎期蛋白, 自分泌炎症介质,合成分泌细胞外基质增加等, 进而主动参与肾小球疾病的进展及肾小球硬化的发生［1］。国外学者和我们的研究均已证实, 细胞骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的高表达是MC增殖/分泌表型的良好标志物,在人类MsPGN中其表达与MC异常增殖及细胞外基质积聚程度密切相关［1,2］。然而, 各种炎症介质如何影响MC的表型转化及其细胞内调控机制迄今知之甚少。

白细胞介素-1β (IL-1β )是MsPGN中刺激MC活化的主要细胞因子之一, 在动物和人类肾炎过程中均已证实MC可分泌IL-1β并表达其受体［3］。丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)家族作为细胞内一类重要的信号转导分子,其不同亚类可调控细胞增殖、凋亡、应激、分化等多种生物学效应［4］。我们曾发现血小板源生长因子(PDGF)对MC表达α-SMA的影响可能是通过MAPK家族中的Raf-1和JNK活性变化调控的［5］。国外研究发现, 外源性IL-1β 在不同细胞中可激活MAPK的不同亚类, 我们也曾证实IL-1β 可刺激MC的JNK活化［6］,但MAPK各亚类信号转导通路对IL-1β 引起的MC表型改变是否具有调控作用目前尚未见报道。本研究中, 我们通过探讨IL-1β 对大鼠系膜细胞(rMC)表达α-SMA的影响以及MAPK家族各亚类信号转导通路的调控作用,以期进一步加深对MsPGN发病机制的认识。

1材料和方法

1.1 主要试剂 IL-1β 购自美国R&D公司, MEK-1特异阻断剂PD98059购自英国Biolabs公司, p38特异阻断剂SB203580购自美国Biochem公司。RPMI-1640培养液及蛋白电泳分子量标准品均购自美国GIBCO公司,胎牛血清购自美国Hyclone公司。小鼠抗α-SMA单克隆抗体购自德国Boehringer Mannheim公司, 单克隆小鼠抗人P-JNK抗体、多克隆兔抗JNK1抗体购自美国Santa cruz公司。Maxi Plasmid Kit购自德国QIAGEN公司。

1.2 质粒扩增、提取及纯化 所用质粒均由美国科罗拉多大学医学中心Raphael A. Nemenoff教授提供, 包括(1) α-SMA启动子(α-SMA-promotor)质粒:7110 bp, 载体为PA3-Luciferase, 插入的α-SMA启动子片段为764 bp, 两端均可为限制性内切酶HindIII识别。(2)β-半乳糖苷酶(β-gal)质粒: 6900 bp, 具有可被限制性内切酶HindIII识别的单位点。(3) PA3-luciferase质粒: 6356 bp,为α-SMA启动子的载体, 用作模拟转染(Mock)。(4) D-JNKK(SEC1)质粒: 显性失活JNKK, 4500 bp, 以SRα3为载体,插入片段两端可为HindIII和Xba1识别。采用氯化钙法制备感受态细菌(DH-5α), 进行质粒转化、扩增, 然后用质粒提取纯化试剂盒(QIAGEN公司)进行提取与纯化。所有质粒经酶切鉴定均符合质粒图谱。

1.3 rMC培养 正常rMC按本所常规方法培养鉴定。手术分离雄性SD大鼠(150～200 g)肾脏, 切碎研磨,分别通过140、80、240目筛网过滤收集肾小球, 经胶原酶消化后, 用含20%胎牛血清(FCS)的RPMI-1640培养液,在37℃、95%空气、5%二氧化碳的条件下进行原代培养, 并经过常规相差显微镜形态学、透射电镜行超微结构及免疫组化染色等鉴定, 证实符合系膜细胞表型特征;实验中采用第3～12代细胞。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞刺激方法 细胞根据实验需要以适当密度转种于细胞培养板或培养皿中, 在正常培养条件下生长适当时间。于实验前换用含0.2%牛血清白蛋白(BSA)的RPMI-1640培养液继续培养24 h, 使其处于生长静止状态。然后加入IL-1β 10 ng/ml分别在不同时间内予以刺激, 以不加刺激的细胞为正常对照。

1.4.2 α-SMA的表达与分布检测

(1) α-SMA蛋白表达检测: 采用蛋白质免疫印迹法。IL-1β 分别刺激2、6、24、48和72 h。各组细胞裂解后取5 μg蛋白为样品, 行10％SPS-PAGE电泳,经90 V恒压电转移2 h, 将样品蛋白转移至硝酸纤维素膜上, 经封闭、洗膜, 在室温下与1∶1000稀释的抗α-SMA抗体反应1 h, 再经洗膜数次并与羊抗鼠HRP-IgG孵育后进行化学发光反应, x线胶片曝光显示条带并经扫描后定量。

(2) α-SMA启动子基因转染及活性测定: 采用电穿孔法。100 μl细胞悬液(3×106/ml)与α-SMA启动子质粒15 μg和β -gal 质粒5 μg于打孔杯内充分混匀,以细胞外基质630基因转导仪进行电打孔基因转染。转染后细胞种入培养皿中, 加适量含20% FCS的培养液, 于孵箱中培养24 h后用于实验。IL-1β刺激时间为3、6和24 h。各组细胞分别以发光仪(LKB-1251)检测萤火虫荧光素酶(luciferase)和β-gal 的活性, α-SMA启动子活性为同一样品中经β-gal活性校正转染效率后的萤火虫荧光素酶活性, 实验结果以实验组与空质粒转染组的比值表示。

(3) α-SMA细胞内分布: 细胞转种于盖玻片上, 加IL-1β刺激24 h。细胞经冷丙酮固定、1% BSA封闭后行免疫荧光染色(小鼠抗α-SMA单克隆抗体1∶50,4℃孵育过夜; FITC标记抗小鼠IgG 1∶50, 37℃孵育30 min), 于共聚焦荧光显微镜下观察α-SMA染色情况。对照组与IL-1β刺激组均各取6～8个视野, 每个视野中≥3个细胞, 分别测定每个细胞及其核周固定区域的平均灰度值, 计算α-SMA核周分布量占总细胞分布量的比值。

(4) 细胞超微结构变化: 正常或IL-1β 刺激后细胞经离心沉淀, 加1%戊二醛固定30 min后, 常规包埋、切片, 用透射电镜观察细胞的变化。

1.4.3 MAPK各亚类通路的阻断实验

(1) ERK和p38通路的阻断: 分别给予50 μmol/L的 MEK-1特异阻断剂PD98059 或50 μmol/L的p38特异阻断剂 sB203580预孵育细胞24 h, 然后给予IL-1β 刺激24 h, 再按前述检测α-SMA蛋白表达。

(2) JNK通路的阻断: 将D-JNKK质粒按前述方法与α-SMA启动子质粒进行共转染, 细胞经IL-1β 刺激5、20和60 min后,采用蛋白质免疫印迹法分别用磷酸化抗体(P-JNK)和非磷酸化抗体(JNK)(稀释度均为1∶ 2000)进行免疫杂交及条带扫描定量确认JNK活性测定变化。于IL-1β刺激6、24 h后检测α-SMA启动子活性及蛋白表达变化。

(3) JNK和p38通路的双重阻断: 按上法对D-JNKK转染的细胞于IL-1β 刺激前预先给予50 μmol/L SB203580预孵育24 h,随后检测α-SMA蛋白表达变化。

1.5 统计学处理 实验结果以mean±SD表示, 各组间比较用ANOVA或t检验分析, 数据用Instat 3.0软件处理, p＜0.05被认为差异有统计学意义。

2结果

2.1 IL-1β 刺激α-SMA表达的特点

iL-1β 刺激6 h即可明显激活α-SMA启动子的活性; 刺激24 h后, IL-1β 对α-SMA启动子的激活作用已经消失。IL-1β 作用早期(2～6 h)对rMC合成α-SMA蛋白无明显影响, 至刺激24 h可明显上调α-SMA蛋白表达, 到72 h其刺激作用基本消失。

2.2 IL-1β 刺激后α-SMA细胞内分布的变化

正常情况下, rMC的α-SMA表达水平很低, 主要呈丝样结构, 贯穿细胞全长, 细胞核无着染。IL-1β 刺激后α-SMA表达量明显增加, 荧光染色增强,除仍有如前的分布外, 细胞核周还出现α-SMA免疫荧光染色的聚集(图2A、 B)。对核周α-SMA免疫荧光染色分布量占总细胞的比值计算结果显示, IL-1β刺激组核周α-SMA分布(0.86±0.09, n=46)较对照组(0.61±0.07, n=49)明显增多(P＜0.001)。

2.3 细胞超微结构改变

iL-1β 刺激后细胞内微丝样结构较对照组增多, 并伴有核周分布增多。

2.4 ERK信号通路在IL-1β 上调α-SMA表达中的作用

单纯应用MEK-1特异阻断剂PD98059作用后rMC的α-SMA表达(30288±19299)与基础状态时(33674±20668)无明显差异。在IL-1β刺激的同时加用PD98059(39717±19144)也未能抑制IL-1β 刺激24 h导致的α-SMA表达上调反应(40196±21037)。

2.5 p38信号通路在IL-1β 上调α-SMA表达中的作用

加入p38信号通路阻断剂SB203580后, 可使基础状态rMC表达α-SMA减少51.4