摘要：研究观察了重组人白介素-10 (rhIL-10)对肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激的离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖、 细胞周期及对p44/p42丝裂素活化蛋白激酶的影响。实验培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞, 采用MTS/PES法确定血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, vSMCs)的增殖状态; 应用流式细胞术测定细胞周期; 利用p44/42磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印迹法测定MAPK蛋白表达。结果显示: (1) TNF-α处理组与对照组相比, tNF-α对VSMC增殖具有明显的刺激作用(P＜0.05)。rhIL-10单独应用对VSMCs生长没有影响(P＞0.05)。在TNF-α刺激下, 低至10 ng/ml的rhIL-10可抑制VSMCs的生长(P＜0.05)。流式细胞术测定的结果显示, rhIL-10分别可使TNF-α作用下的VSMC大部分处于G0/G1期,与对照组相比有明显差异(P＜0.01)。(2) TNF-α对p44/p42 MAPK蛋白表达有显著的增强作用, 此作用可被rhIL-10抑制。结果提示, rhIL-10可抑制TNF-α诱导的VSMC增殖及p44/p42 丝裂素活化蛋白激酶的表达。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖和表型改变是动脉粥样硬化的主要病理基础。日益增多的证据表明动脉粥样硬化是一个对血管损伤的过度炎症反应。血管损伤后,单核细胞和淋巴细胞粘附到血管壁, 释放一系列细胞因子和肽类生长因子, 这些生长调节物与他们的特异性受体结合后, 转导影响血管平滑肌细胞表型和生长的信号,动脉粥样硬化病变处的VSMC表达HLA-DR, 参与T细胞的抗原递呈, 表明T细胞与VSMC的相互作用可导致动脉粥样硬化的发生[1]。 白介素-10(interleukin-10, IL-10)是一种被识别的具有抑制T细胞、 单核细胞和巨噬细胞激活及其效应子包括单核因子的合成、 Ⅱ类MHC和共刺激分子如CD80/CD86表达等9δ?并对大多数类型造血细胞有多种作用的多功能细胞因子。丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通过磷酸化激活多种转录因子,影响基因表达, 调节细胞增殖。MAPK在介导炎症反应中起着重要的作用[2]。在动脉粥样硬化斑块内的合成型VSMC及PTCA术后内膜损伤处的VSMC均有MAPK活性的增高[3]。p44/42是MAPK的重要成员之一。本研究报告了重组人IL-10在单独和与TNF-α同时存在时对VSMC细胞周期和对VSMC中p44/42 mAPK蛋白表达的影响, 以进一步探索重组人白介素-10应用于以VSMC增殖为主的心血管疾病治疗的可能性。

重组人IL-10 (rhIL-10)为本实验室经基因重组、 分离纯化后获得, rhIL-10蛋白采用Western blotting检测鉴定, 纯度＞90%; rhIL-10的生物学活性测定是利用重组白介素-１０对LPS致昆明种小鼠感染性休克模型有保护作用的特性来进行的(尚未发表资料)。

血管平滑肌细胞的原代培养参考王道生[4]贴块法进行。选用6周龄雄性SD大鼠(第一军医大学实验动物中心提供)断头处死,取胸主动脉中膜以贴块法培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco BRL公司)中, 置于37℃、 5% CO2孵箱中培养, 细胞经抗α-actin抗体鉴定为VSMC。实验所用的VSMC均为第3～6代传代细胞。

细胞增殖评价96孔板中以5000个细胞/孔的密度铺板。8 h后换成无血清、 含谷氨酸的DMEM培养基, 维持48 h后换成含5% FBS的DMEM培养基及相应的实验试剂。每组实验重复6次,每一组每次为6 个孔, 对照组为含5% FBS的DMEM培养基, 24 h后, 细胞的增殖率用Cell Titer 96 Assay MTS/PES试剂盒(Promega co.USA, Cat#5421)确定。用Microplate reader （以490 nm, Bio-Rad 550）测量吸光度,细胞的增殖率用吸光度来表达。

流式细胞仪对血管平滑肌细胞周期的检测制备单细胞悬液, 使细胞数为1×106/ml; 加冰无水乙醇在4℃固定细胞24 h。加入1 ml的碘化丙啶(Propidium iodide, PI, Sigma公司)染色液至离心管细胞片状沉淀物, 加入50 μg/ml的Rnase A原液, 4℃孵育3 h;在流式细胞仪Elite(美国Coulter公司)上进行分析。

p44/42 MAPK蛋白免疫印迹测定静止的VSMC在分别单独用20 ng/ml的人TNF-α (Sigma公司)、 100 ng/ml的rhIL-10及100 ng/ml 的rhIL-10与20 ng/ml的TNF-α同时共同作用, 以不含TNF-α的DMEM培养液作为对照组, 30 min后, 加入500 μl细胞裂解液和50 μl PMSF, 收获细胞, 200 μl细胞提取液加15 μl磷酸化p44/42 MAPK单克隆抗体4℃轻摇4 h, 4℃ 12000转离心10 min, 加入50 μl激酶缓冲液、 200μmol/L ATP和2 μg ELK-1融合蛋白重新悬浮, 30℃孵育30 min, 用25 μl 3×SDS样品缓冲液终止反应, 95℃加热5 min使蛋白变性, 离心取蛋白质上清20 μl用10% SDS聚丙烯酰胺电泳分离蛋白质,将已分离的区带用电转移仪转移到PVDF膜上, p44/42磷酸化抗MAPK抗体(1∶1000稀释; p44/42 MAP激酶检测试剂盒购自New England biolabs, Catalog #9800)室温孵育2h, HRP连接的二抗(1∶2000稀释)室温孵育1h, 用化学发光法检测蛋白印记条带,结果用影像软件Smart view分析。

统计学处理所有数据以 mean±SE表示, 应用SPSS软件包, 采用ANOVA和Student-Newman-Keuls 检验分析。

实验结果如下:

1. TNF-α和rhIL-10分别对VSMC增殖的影响

单独的rhIL-10在不同剂量下对大鼠VSMC的增殖均无影响(P＞0.05); 100 ng/ml和20 ng/ml TNF-α单独作用时均可明显刺激VSMC增殖,与对照组相比有显著性差异。

2． rhIL-10对TNF-α介导VSMC增殖的抑制作用

tNF-α(20 ng/ml)可促进VSMC增殖; 而当20 ng/ml的TNF-α与10 ng/ml或100 ng/ml的rhIL-10同时存在时, TNF-α促进VSMC增殖的作用被rhIL-10抑制,与TNF-α组相比有显著性差异, 但未存在剂量依赖性。表明rhIL-10能够在体外抑制由TNF-α介导的VSMC增殖。实验所用细胞的台盼蓝染色证实细胞处于存活状态。肌细胞周期的影响。

3. 流式细胞仪对血管平滑肌细胞周期的检测

表3结果表明, rhIL-10能够使TNF-α或作用下的VSMC大部分集中在G0/G1期, 与对照组相比, 有显著的差异(P＜0.01)。4. p44/42 mAPK蛋白免疫印迹测定以对照组的密度扫描结果为100, 单独的rhIL-10对p44/42 MAPK没有明显的作用(110±35, P＞0.05)。TNF-α对p44/42 MAPK有显著的激活作用(566±89, P＜0.001), 而rhIL-10与TNF-α同时作用于VSMC时, rhIL-10可以抑制TNF-α对p44/42 mAPK的激活作用(304±47, P＜0.001)。重复3次得到相同的结果。

我们的结果显示, TNF-α能明显刺激VSMC的增殖, 使G0/G1期细胞进入G2/M期(P＜0.01); 同时能触发p44/42 MAPK的磷酸化,使p44/42 MAPK激活(P＜0.001)。TNF-α诱导VSMC增殖的机制目前仍不十分清楚。目前的研究表明TNFp75受体通过MAPK系统促进细胞增殖[5]。

已知rhIL-10的主要功能是限制和最终终止炎症反应。在人LPS刺激的单核细胞, rhIL-10可抑制IL-1、 TNF、 IL-6和IL-8的产生,在对健康志愿者给予内毒素后, rhIL-10能够降低LPS诱导的体温增加和循环中的TNF、 IL-6和IL-8[6]。我们的结果显示, 在大鼠胸主动脉的VSMC, rhIL-10能够抑制20 ng/ml TNF-α刺激的VSMC增殖, 而对正常情况下的VSMC生长无影响,对非刺激情况下VSMC中的p44/p42 MAPK也无影响(P＞0.05)。rhIL-10可明显抑制TNF-α诱导的VSMC增殖, 与国外的报道类似[7]。流式细胞术结果显示rhIL-10能够使在TNF-α作用下的VSMC大部分集中在G0/G1期,从而部分阻断了TNF-α诱导的VSMC增殖。新近的研究表明, rhIL-10能够抑制神经胶质细胞由TNF-α诱导的MAP激酶瀑布中p44/42 MAPK的表达及人外周血中树突状细胞由TNF-α诱导的MAP激酶瀑布中p38 mAPK的表达[8, 9]。本实验显示, TNF-α可以明显诱导VSMC中p44/42 MAPK的激活, 导致VSMC增殖, 而rhIL-10通过抑制TNF-α诱导的MAP激酶瀑布中p44/42 mAPK的磷酸化, 从而抑制了VSMC的增殖。

综上所述, rhIL-10能明显抑制由TNF-α诱导的大鼠VSMC增殖和TNF-α诱导的大鼠VSMC中p44/42 MAPK的磷酸化。

参考文献

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[２]Jiang Y (姜勇), Gong XW (龚小卫). Regulation of inflammatory responses by MAPK signal transduction pathways. Acta Physiol Sin (生理学报), 2000,52(4):267～271(Chinese, English abstract).

[３]Kim S, Izumi Y, Yano M, Hamaguchi A, Miura K, Yamanaka S, Miyazaki H. angiotensin blockade inhibits activation of mitogen-activated protein kinases in rat balloon-injured artery. Circulation, 1998,97(17):1731～1737.

[４]王道生． 动脉平滑肌细胞培养方法． 徐淑云主编. 药理实验方法学. 北京: 人民卫生出版社, 1991. 353～358.

[５]Baker SJ, Reidy EP. Transducers of life and death: TNF receptor superfamily and associated protein. Oncogene, 1996,12:1～9.

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[７]Selzman CH, McIntyre RC, Shames BD, Whitehill TA. Interleukin-10 inhibits human vascular smooth muscle proliferation. J Mol Cell Cardiol, 1998,30:889～896.

[８]Tan J, Town J, Saxe M, Paris D, Wu Y, Mullan