摘要：为探讨八肽胆囊收缩素(CCK8)缓解内毒素休克时肺动脉高压的作用机制, 应用离体血管环张力测定技术及一氧化氮合酶(NOS)检测方法,观察了一氧化氮(NO)在CCK8减轻肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factoralpha, TNFα)的抑制肺动脉内皮依赖性舒张反应中的作用。结果显示: tNFα (4*#000 U/ml)孵育2 h时, 肺动脉对10－６ mol/L 苯肾上腺素(phenylephrine, PE)和10－６ mol/L乙酰胆碱(ACh)的收缩反应及内皮依赖性舒张反应均无明显变化。TNFα 孵育7 或14 h时, 肺动脉对10－６ mol/L ACh介导的内皮依赖性舒张反应降低, cCK8 (0.5 μg/ml)可逆转TNFα 的上述作用。CCK8本身对正常肺动脉反应性无明显影响。 TNFα、 CCK8对PE引起的收缩反应无显著影响。L精氨酸(LArg)可使TNFα7 h组内皮依赖性舒张作用恢复。氨基胍(AG)不影响各组肺动脉对10－６ mol/L ACh的内皮依赖性舒张反应, 而使TNFα 组肺动脉环对10－６ mol/L PE的收缩反应显著增加。L硝基精氨酸(LNNA)使各组肺动脉环对10－６ mol/L ACh反应由舒张变为收缩, 对10－６ mol/L pE的收缩反应显著增强。检测7 h各组NOS活性, TNFα 组、 TNFα+CCK8组均较对照组显著增加, CCK8组与对照组比较无显著差异。上述结果提示, cCK8可逆转TNFα 对内皮依赖性舒张反应的抑制作用, 此作用可能与NO有关。临床败血症和实验性内毒素休克(endotoxic shock, ES)常出现肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, pAH)［1］, 其发病机制尚未完全明了。 肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factoralpha, TNFα)是内毒素或其活性成分脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导多种靶细胞产生的前炎性细胞因子, 给动物注入TNFα 可引起同ES相似的PAH,但TNFα 致ES时PAH的作用机制目前还不清楚。TNFα 可诱导大鼠肺微血管内皮细胞iNOS mRNA表达而抑制eNOS mRNA表达,提示NO在病理及生理状态下微血管的调节中具有重要意义［2］。我室近年研究表明, 八肽胆囊收缩素(cholecystokininoctapeptide, CCK8)具有抗ES及PAH的作用［3,4］,但CCK8对TNFα 诱导的肺动脉反应性改变有何影响, 以及一氧化氮(NO)的作用, 尚未见报道。本研究在离体水平观察CCK8对TNFα引起的肺动脉反应性改变的影响及NO的作用,以探讨CCK8缓解PAH的作用机制。

1材料和方法

1.1 材料TNFα、 硫酸化CCK8、 氯化乙酰胆碱(ACh)、 硝普钠(SNP)、氨基胍(AG)、 L硝基精氨酸(LNNA)及消炎痛均为Sigma产品,苯肾上腺素(PE)购于上海天丰制药厂,RPMI1640培养基为美国Gibcobrl产品, L精氨酸(LArg)由中国科学院微生物研究所提供。其余试剂均系国产分析纯。NOS活性测试盒由南京聚力生物医学工程研究所提供。

1.2 离体肺动脉环的制备［8］纯种新西兰家兔(2.0～2.5 kg), 雌雄不拘, 实验前禁食12 h,不禁水。25%乌拉坦腹腔注射麻醉后放血处死。迅速联合摘取心肺, 在预冷(4℃)并通入95%O25%CO2的KrebsRinger bicarbonate(KRB)液中, 分离两侧近端的肺动脉, 剔除外膜粘附的结缔组织, 避免损伤动脉内皮细胞, 剪成约2.5 mm长的血管环,每只家兔制备6～8个血管环(n代表血管环数)。

1.3 实验分组TNFα组、 TNFα+CCK8 组、 CCK8组及溶剂对照组。将肺动脉环置于RPMI1640培养液(溶剂)中, 每2 ml培养液中含2个血管环, 用4*#000 U/ml TNFα， 或加0.5 μg/ml CCK8, 单用0.5 μg/ml CCK8或溶剂,在CO2孵箱中(37℃、 5% CO2)分别孵育2、 7或14 h。

1.4 肺动脉环张力测定把预处理的肺动脉环垂直挂于夹层器官槽中, 一端固定于槽底部,一端通过张力换能器与平台记录仪(四川仪表总厂)相连。槽中通有37℃恒温含10－5 mol/L消炎痛(以消除环氧酶代谢产物的影响)的KRB液, 并持续充入95% o25% CO2混合气体。血管环在2 g张力下平衡1 h, 每15 min换液一次。用平台记录仪描记血管环张力变化。用PE (10－６ mol/L)检测肺动脉环的反应性, 待确认其反应性稳定后, 在PE (10－６ mol/L)预收缩的血管环上, 观察对ACh (10－６ mol/L)的内皮依赖性舒张反应。为探讨NO的作用, 分别用LArg (2×10-３ mol/L)、 AG (10－４ mol/L) 或LNNA (10－４ mol/L) 预孵育15 min, 比较孵育前后肺动脉环对10－６ mol/L PE及ACh反应性的改变。对前一试剂的反应完成后, 用KRB液冲洗至张力回到基线后进行下一试剂的反应。实验结束后留取肺动脉烘烤至恒重,以标化张力。收缩反应变化用克·张力/毫克·干重(g·tension/mg·dw)表示。舒张反应变化用舒张张力占同组PE收缩张力的百分比表示。

1.5 NOS活性测定(按试剂盒说明操作)按前述分组孵育7 h时, 取出血管环, 用0.9% 生理盐水洗３次, 迅速称重后,置于－70℃保存待测。制备肺动脉环匀浆, 离心10*#000 r/min, 4℃, 5 min, 取上清液50 μl加入反应液150 μl,混匀后37℃水浴15 min, 加入反应终止液1 ml, 立即在540 nm波长处测定其消光值。NOS催化其底物LArg生成NO, nO与显色液中的二价铁配合物形成有色物, 在540 nm波长处测的消光值即代表NOS活性。酶活性定义为每毫克组织蛋白每分钟生成的1 nmol nO为一个活性单位, 即U/mg蛋白质。蛋白含量采用改良酚法。

1.6 统计学处理数据用mean±SE表示, 给药前后行配对t检验, 组间差异用单因素方差分析(one way ANOVA), 有显著差异者用NewmanKeuls q 检验进行两两比较, 以P＜0.05为有统计学意义。

2结果

2.1 TNFα对肺动脉内皮依赖性舒张反应的影响

孵育2 h, TNFα 对10－６ mol/L ACh引起的肺动脉内皮依赖性舒张反应无显著影响。 孵育7或14 h,TNFα使肺动脉对10－６ mol/L aCh的内皮依赖性舒张反应百分比较对照组的79.50±2.97% 和 81.57±1.58% 分别下降至63.82±2.05% 和71.55±4.02%, p值依次＜0.01、＜0.05 。

cCK8与TNFα共同孵育7 或14 h, 可逆转TNFα 对内皮依赖性舒张反应的抑制作用, 增强肺动脉对10－６ mol/L ACh 的舒张反应。

cCK8单独孵育不同时间组的肺动脉对ACh的内皮依赖性舒张百分比与溶剂对照组比较, 均无显著性差异(P＞0.05)。

2.2 TNFα对肺动脉收缩反应的影响

tNFα、 CCK8单独及共同孵育2、 7、 14 h, 对10－６ mol/L PE引起的肺动脉收缩反应均无显著影响。TNFα 14 h组肺动脉收缩反应有所降低, 但无统计学意义。

2.3 LArg、 AG或LNNA对肺动脉反应性的影响

lArg使TNFα 7 h组内皮依赖性舒张作用恢复(图3)。AG不影响ACh的内皮依赖性舒张反应, 而使TNFα 组收缩显著增加(7 h P＜0.05,14 h P＜0.01)。 LNNA使肺动脉环对 ACh反应由舒张变为收缩, 对PE收缩较LNNA孵育前显著增加(P＜0.01),而与AG孵育后PE收缩值比较, TNFα 组无显著差异, 其余各组均显著增加。

2.4 NOS活性测定

检测7 h各组NOS活性, TNFα 组、 TNFα+CCK8组均较对照组显著增加, P＜0.05。CCK8组与对照组比较无显著差异。

3讨论

本实验观察了CCK8、 TNFα 单独或共同孵育离体兔肺动脉对血管活性物质诱导的反应性变化的影响, 并在消除前列环素影响的基础上,探讨了这种变化与肺动脉NO的关系。结果提示TNFα 可能通过抑制肺动脉对ACh的内皮依赖性舒张反应促使PAH发生。Greenberg等［5］用TNFα(1.25 μg/ml)孵育分离的牛肺动脉1 h, 显著抑制对ACh的内皮依赖性舒张反应; 在分离的动脉上, TNFα似乎能选择性地抑制受体介导的内皮依赖性舒张作用。此外, TNFα可时间和剂量依赖性地使内皮细胞中固有型一氧化氮合酶(cNOS)的稳定性降低、 mRNA减少［6］。本研究结果提示, TNFα 可能通过抑制胆碱能受体介导的内皮衍生性NO的释放, 从而抑制肺动脉对ACh的内皮依赖性舒张反应。

我室已证实, CCK8具有对抗 ES［3］及其发生过程中PAH 的作用［4］。本实验证实的TNFα 抑制肺动脉内皮依赖性舒张作用可能是内毒素导致PAH形成的机制之一, cCK8 可以显著逆转此抑制作用, 这与CCK8可逆转LPS对肺动脉的内皮依赖性舒张反应的抑制作用结果一致［7］。CCK8的保护作用机制可能有:(1)减轻内皮细胞结构损伤: 我们应用电镜观察到CCK8可减轻血管内皮病变［8］; (2)抗氧化作用: 凌亦凌等［9］研究表明CCK8可使内毒素休克大鼠血中SOD含量增加,表明CCK8有一定的抗氧化作用。Amari等［10］报道, O·〖TX-*8]2 参与TNFα 诱导的PAH生成, 而SOD可减轻早期和晚期的PAH。O·〖TX-*8]2使NO失活, 从而干扰对ACh的内皮依赖性舒张作用; (3)受体介导作用: 已有报道肺内存在CCK受体［11］, CCK8的肺保护作用可能由其受体介导。

nOS底物LArg可使TNFα 7 h组内皮依赖性舒张作用恢复。LArg是血管内皮产生NO的关键的调节物质,它通过载体介导的钠通道转运进入肺血管内皮细胞。在没有血管损伤的情况下, LArg在内皮产生NO的过程中通常不是限速因子［12］。本实验中TNFα组以外的其余组LArg孵育前后肺动脉对ACh的舒张百分比均无显著差异, 提示内皮细胞未受损。此亦表明CCK8具有保护内皮细胞的作用。在病理状态内皮衍生NO减少的情况下, lArg可使内皮衍生NO的产生恢复［12］。

aG对ACh的内皮依赖性舒张反应无显著影响, 表明该浓度的AG对cNOS的抑制作用轻微; 而AG使TNFα组收缩显著增加, 提示有诱生型一氧化氮合酶(