摘要：应用高香草酸荧光分析技术及NADH-高铁氰化钾还原酶法, 对正常和Graves病甲状腺过氧化氢(H2O2)和NADH-细胞色素b5还原酶(b5R)进行测定, 发现Graves病甲状腺b5R活性和H2O2水平均明显高于正常, 而 H2O2酶活性在Graves病和正常甲状腺间无显著差异。加b5R抑制剂对氯汞苯甲酸抑制b5R活性, Graves病和正常甲状腺b5R活性降低近85%, 同时H2O2降 低近50％, 蛋白结合碘形成减少近52%。b5R活性和 h2O2水平两者呈显著正相关关系。以上结果表明, b5R 参与甲状腺内H2O2的生物合成, 是甲状腺内产生 H2O2的重要酶系。甲状腺激素的合成需要碘、 甲状腺球蛋白、 过氧化物酶和过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)四者同时存在, 缺一不可。 h2O2作为甲状腺激素合成的重要底物和成分, 在甲状腺激素的生物合成中有重要作用。甲状腺内H2O2生成不足必将导致甲状腺激素合成障碍[1,2]。因此, h2O2与甲状腺激素合成关系密切。近20多年来, 人们一直在探讨甲状腺内H2O2生成的生化机制, 提出一些可能产生H2O2的酶系[2~4],但仍有争论。本文应用高香草酸荧光分析技术及NADH-高铁氰化钾还原酶法对甲状腺组织的H2O2和NADH-细胞色素b5还原酶(NADH-cytochrome b5 reductase, b5R)进行测定, 同时应用b5R抑制剂对氯汞苯甲酸抑制b5R活性, 观察b5R活性变化对H2O2生成的影响,以探讨b5R在H2O2生物合成中作用。

1 材料和方法

1.1 实验对象 手术治疗的Graves病(Graves' disease, GD)病人15例, 男性4例, 女性11例,平均年龄35.3±9.4岁。GD诊断的依据为典型的临床表现、 血中FT3、 FT4升高, 超灵敏TSH降低, TRAb阳性, 甲状腺B型超声检查和SPECT检查无结节等。所有病例术前均用他巴唑治疗2个月以上,甲状腺功能已恢复正常, 手术时取新鲜甲状腺组织。另选15例与之年龄、 性别相匹配进行手术治疗的甲状腺良性腺瘤患者, 其血中FT3、 FT4、 sTSH、 TGA、 mCA、 TPOAb均正常, 手术时取其远离腺瘤的正常甲状腺组织作对照。全部病例均经病理证实, 实验用的甲状腺组织事先均征得手术治疗GD病人的同意。

1.2 试剂 NADH二钠盐、 HEPES、 高香草酸、 辣根过氧化物酶Ⅱ型为 Sigma公司产品, 对氯汞苯甲酸系英国Colmbrook产品,其余高铁氰化钾、 EDTA二钠盐、 Tris-HCl缓冲液、 氯化钙、 葡萄糖等为国产分析纯试剂。

1.3 b5R活性测定 以高铁氰化钾为底物, NADH为辅酶, 在b5R催化下高铁氰化钾还原为亚铁氰化钾, 同时NADH被氧化成NAD+, 在波长为340 nm处随着NADH的氧化, 吸光度下降, 其下降速度与酶活力成正比。手术取新鲜甲状腺组织, 在4℃低温下称重、 剪碎、 匀浆后,用J2-21高速冷冻离心机(Beckman公司 ) 和SCP85Ⅱ超速低温离心机 (Hitachi公司) 经700×g、 8500×g及105000×g离心分离微粒体。按俞秀玲等人的方法[5], 在测定杯中加2 mmol/L高铁氰化钾300 μl, 1 mol/L Tris-HCl缓冲液300 μl, 微粒体悬液0.5 ml, 加水补足至2.95 ml, 对照杯加入上述同样试剂, 但不加微粒体悬液。通过加10 mmol/L NADH 50μl启动反应, 用752 C紫外可见分光光度计在340 nm波长处立即测零时的吸光度。此后每隔30 s测吸光度1次, 共测3 min。每个样本设3个复管,以3个复管平均值为测定值。以每分钟转化1 μmol底物的酶量为1个酶单位。批内变异系数7.2%, 批间变异系数9.3%。为观察对氯汞苯甲酸对b5R活性影响,加0.5 mmol/L对氯汞苯甲酸预孵育5 min再测b5R活性。

1.4 H2O2测定 参考Raspe法[6],反应体系中无荧光的高香草酸在H2O2和辣根过氧化物酶存在下转化为强荧光的高香草酸衍生物(2-2'-dihydroxy-3, 3'-dimethoxy biphenyl-5, 5'-diacetic acid), 荧光强度与H2O2量成正比。甲状腺组织加4倍体积(W/V) 20 mmol/L HEPES缓冲液(含1 mmol/L二巯基苏糖醇、 16 mg/L 苯甲磺酰氟和3 mmol/L Na2HPO4), pH 7.4, 在4℃下剪碎、 匀浆、 过滤, 4200×g,4℃离心15 min, 沉淀加2倍体积上述HEPES 缓冲液。加Ⅱ型辣根过氧化物酶 (1 mg/ml) 300 μl, 高香草酸(1 mg/ml) 240 μl,上述沉淀悬液150 μl, 0.1 mol/L NaN3 30 μl, 加HEPES缓冲液至3 ml。置于37℃恒温振荡器孵育30 min后,马上置于冰上终止反应, 用RF-5301PC型荧光分光光度计(日本岛津)以激发波长315 nm, 发射波长425 nm测定。以已知不同含量 h2O2在上述同样反应条件下测得值制作标准曲线, 每个样本设两个复管, 以两个复管平均值为测定值。 批内变异系数7.1%。批间变异系数8.9%。在测定体系加0.01% H2O2酶, 观察对H2O2水平的影响。

1.5 H2O2酶测定 H2O2酶测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。按试剂盒操作步骤, 以微粒体上清液用752 c紫外可见分光光度计测定。以每毫克组织中H2O2酶每秒钟分解吸光度为0.50 的H2O2相对量为1个单位。蛋白质定量采用改进的Lowry (1951) 法。

1．6 蛋白结合碘(PBI)测定 参考Kusakabe法[7], 建立碘有机化系统, 甲状腺匀浆在含KI、 Na131I、 NaCl、 磷酸盐缓冲液等 (pH7.4)的碘有机化系统37℃孵育 2 h, 加20%三氯醋酸终止碘化反应, 离心后测沉淀物PBI放射性脉冲, 加0.5 mmol/L 对氯汞苯甲酸(PCMB),观察对PBI形成的影响。结果以pmol/mg组织表示。

1．7 统计学分析 两组间均数比较用非配对t检验, 两变量间关系用直线相关分析。结果用mean±SD表示。

2 结果

2.1 正常和GD甲状腺b5R和H2O2酶的活性

为了更全面观察正常和GD甲状腺b5R活性, 选用酶总活力和酶比活性两个指标来测定正常和GD甲状腺b5R活性。用酶总活力表示, GD甲状腺与正常甲状腺相比,其b5R活性明显高于正常 (P＜0.05); 用酶比活性表示, GD甲状腺b5R活性也明显高于正常(P＜0.05)。但无论是GD还是正常甲状腺,其H2O2酶活性无明显差别(P＞0.05) 。

2.2 正常和GD甲状腺的H2O2水平

用高香草酸荧光分析技术测定H2O2, 正常甲状腺H2O2处于较低水平, 发生GD时, 其甲状腺H2O2水平明显高于正常(P＜0.05); 加H2O2酶后,正常甲状腺H2O2降低81.9%, GD甲状腺H2O2降低84%, 两者均显著降低 (P均＜0.05), 表明所测定的为对H2O2酶敏感的 H2O2。

2.3 b5R抑制剂对b5R活性、 H2O2水平和PBI形成的影响

为直接观察b5R在甲状腺H2O2生物合成中作用, 应用b5R抑制剂对PCMB抑制b5R活性, 观察b5R活性受抑制后H2O2水平和PBI形成变化。结果加PCMB后, gD甲状腺组织的b5R活性降低82.7%, 同时H2O2水平降低49.6%, 两者均显著降低 (P均＜0.05); 随b5R活性和H2O2水平降低, PBI减少53.8%(P＜0.05)。正常甲状腺加PCMB后亦有类似变化, b5R活性降低87.1%, H2O2水平降低48.6％, 两者亦显著降低 (P均＜0.05); 同时PBI减少51.3%(P＜0.05)(图1)。但无论GD还是正常甲状腺在加PCMB后H2O2酶活性均无明显改变(图未显示)。

2.4 b5R活性和H2O2水平相关性

将15例正常和15例GD甲状腺的b5R活性与H2O2水平进行相关分析, 结果两者显著正相关(r=0.8172, P＜0.05)。

3 讨论

甲状腺激素的生物合成需要H2O2。 在甲状腺激素合成过程中碘离子氧化、 酪氨酸的碘化及碘化酪氨酸的偶联均需H2O2存在, 缺少H2O2, 即使有足够的碘,其碘离子也无法氧化成活性碘, 酪氨酸的碘化及碘化酪氨酸的偶联也难以进行,甲状腺激素亦无法合成。甲状腺内H2O2浓度被认为是决定酪氨酸碘化和碘化酪氨酸偶联反应速率的关键因素, 因而是甲状腺激素合成的限速步骤[8]。临床上已发现,甲状腺内H2O2生成不足的病人会发生碘有机化障碍。 甲状腺激素合成不足, 临床表现为甲状腺肿和甲状腺机能减退,而在体外提供H2O2则使碘有机化恢复正常[1]。因此H2O2在甲状腺激素生物合成中起关键作用。近年还发现, h2O2本身亦可直接作为信号分子引起细胞的增殖和功能改变[9~11]。因此, H2O2与甲状腺疾病关系密切,在多种甲状腺疾病的病理生理中可能有重要作用。近20多年, 人们开始注意甲状腺内H2O2的重要性, 对其进行研究, 试图探明甲状腺H2O2生成的生化机制,提出了一些可能涉及H2O2产生的酶系[2~4], 但仍存在争论。本文应用高香草酸荧光分析技术直接测定H2O2含量,发现甲状腺H2O2水平与b5R活性密切相关。正常甲状腺b5R活性维持较低水平, 其H2O2也处于较低水平; 发生GD时b5R活性增高,其H2O2水平亦随之增高。相关分析也表明两者呈正相关关系。

b5R是一种两性黄素蛋白, 以FAD为辅基, 由300个氨基酸组成, 在C端的100个氨基酸中含有4个在功能上十分重要的半胱氨酸,其中之一是快反应半胱氨酸(fast reacting cysteine), 其巯基基团是酶活性中心的重要构成, 为酶活性所必需。PCMB为巯基抑制剂,它可进入b5R酶的活性中心与巯基反应, 抑制b5R的活性。为了进一步证实b5R和H2O2的因果关系, 我们用b5R抑制剂PCMB,观察抑制b5R活性前后H2O2的变化。 结果发现, PCMB抑制b5R活性后, H2O2水平也同时下降, H2O2水平与b5R活性呈同步一致变化,这进一步证实b5R是产生H2O2的重要酶系。为了排除PCMB非选择性抑制所有的酶, 从而引起H2O2水平下降, 我们观察了H2O2酶在应用PCMB前后的活性变化。结果发现,在应用PCMB后H2O2酶活性无明显变化, 说明PCMB并非无选择地抑制所有的酶而引起H2O2水平下降, 而是有选择性地抑制b5R,从而抑制H2O2的合成。b5R虽为产生H2O2的重要酶系, 但本文资料表明PCMB几乎完全抑制b5R活性, 但甲状腺内H2O2的产生仍未受到完全抑制,这提示甲状腺内H2O2的产生可能还有其他途径, 可能由几种不同酶系共同产生, 而非由b5R单一途径产生, 这种机制有利于甲状腺内H2O2保持稳定浓度,保证甲状腺激素生物合成的需要。甲状腺内H2O2的量不仅与产生有关, 还与H2