摘要：用血小板聚集、 粘附、 释放实验和出血时间测定观察L-精氨酸·L-门冬氨酸盐(DR)对血小板功能的作用。实验结果显示: DR 15 mg/kg静脉给药,可明显抑制腺苷二磷酸(ADP)诱导的大鼠血小板聚集(P＜0.01); 15 mg/kg单次口服给药可明显抑制ADP诱导的家兔血小板聚集; 其药效可持续8 h以上(P＜0.01); DR 7.5、 15、 30 mg/kg灌胃给药(Bid×3.5 d), 可明显抑制ADP、胶原或凝血酶诱导的大鼠血小板聚集(P＜0.01), 并延长出血时间(P＜0.05)。 DR 30 mg/kg可明显抑制大鼠血小板粘附,并促进血管内皮释放前列环素(PGI2), 但对活化的血小板释放血拴素(TXA2)无明显影响。本研究发现, DR可抑制血小板聚集和粘附功能,其作用机制不同于阿司匹林。这些作用部分是由于DR增加了血管内皮PGI2的释放。此结果为血小板功能的调节提供了新线索。血小板在生理性止血和病理性血栓形成过程中发挥重要作用, 有多种因素参与血小板功能的调节: 内源性的血小板聚集诱导剂(如ADP、 凝血酶、 肾上腺素、 tXA2等)与血小板膜受体结合, 会引起血小板活化、聚集, 血小板内cAMP和cGMP浓度增加,血液中的PGI2和NO水平升高可抑制血小板聚集。因此从不同途径干预血小板功能, 是血小板相关疾病特别是血栓性疾病防治的必要手段, 如用阿司匹林(ASA)作为环氧酶抑制剂,通过阻止血小板TXA2的合成抑制血小板聚集; 用双嘧达莫抑制PDE, 升高血小板内cAMP水平抑制血小板聚集［1］。L-精氨酸·L-门冬氨酸盐(L-argnine·L-aspartate, dR)为已知的化合物, 一直作为生化试剂应用［2］。近年来研究认为, 血浆中的纤维蛋白原与其受体的结合,是各种诱导剂引起血小板聚集的共同通路［3］。纤维蛋白原受体αⅡbβ3 (GPⅡb/Ⅲa)为血小板表面的跨膜糖蛋白, 血小板在静息状态下, gPⅡb/Ⅲa胞浆区的α与β亚基之间有一门冬氨酸和精氨酸形成的盐桥(D-R), D-R的存在使GPⅡb/Ⅲa处于非信号转导状态;当盐桥断裂时GPⅡb/Ⅲa进入信号转导状态, 与纤维蛋白原结合, 引起血小板活化、 聚集［4］。因此设想, 保护盐桥免遭破坏, 即阻止该受体活化,也可抑制血小板聚集。DR与体内的D-R结构相似, 两者的精氨酸与门冬氨酸之间均为离子键结合, 前者有可能作为盐桥保护剂而抑制血小板功能,但未见有相关的文献报道。 因此, 我们合成了DR, 观察其对血小板功能的影响, 旨在发现血小板功能调节的新途径。

1材料和方法

1.1材料实验用雄性Wistar、 SD大鼠与雄性家兔, 购自本校试验动物部。 DR由本研究组合成, 临用时溶于蒸馏水(ig)或生理盐水(iv); ASA临用前研细,溶于蒸馏水或生理盐水(1.5 mg/ml); ADP和凝血酶购自Sigma公司, 用时溶于生理盐水; 胶原溶液按参考文献制备［5］,胶原蛋白含量用蛋白测定试验盒测定(中生生物技术工程公司产品), TXB2放免药盒为东雅生物技术研究所产品。

1.2 实验方法

1.2.1大鼠血小板聚集实验(ex vivo iv)雄性Wistar大鼠(430～470g), 按体重平均分为DR 15 mg/kg组和生理盐水组,每组5只。 戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg ip), 静脉推注生理盐水或DR (0.5 ml/100 g), 处理后5 min腹主动脉取血, 按常规方法制备PRP和PPP,血小板数调至3.5～4.0×108个/ml, 血小板聚集参考以前方法在双道血小板聚集仪(Sienco.DP-247E)上进行［6］, 诱导剂为ADP (终浓度:1×10－6～5×10－6mol/L)。

1.2.2 大鼠血小板聚集试验(ex vivo ig)雄性Wistar大鼠(250～300 g) 70只, 分为7组: 溶媒对照组、 DR 1.5、 3.0、7.5、 15、 30 mg/kg和ASA 30 mg/kg组。动物给药7次(bid×3.5 d ig), 末次给药后1 h, 戊巴比妥钠麻醉, 腹主动脉取血,按常规方法制备PRP和PPP, 血小板数调至3.5×108～4.0×108个/ml, 诱导剂为ADP (终浓度: 1×10－６～5×10－6mol/L),胶原(终浓度4０～50 μg蛋白/ml)或凝血酶(终浓度0.06～0.07 IU/ml)。血小板聚集实验同1.2.1。

1.2.3 家兔血小板聚集实验(ex vivo po)雄性家兔(2.5～3.8 kg) 12只, 分为两组: 空白对照组和DR 15 mg/kg组。空白组动物口饲饲料粉末胶囊, 处理组动物口饲掺入DR的饲料粉末胶囊, 分别在处理前、 后1、 2、 4、 6、 8 h取血, 以ADP为诱导剂,进行血小板聚集活性测定。

1.2.4 血小板粘附实验雄性SＤ大鼠(250～300 g) 50只, 按体重平均分为5组, DR处理同1.2.1。末次处理后1 h麻醉, 取动脉血,先进行粘附前计数。 然后取同一份抗凝血1.3 ml加入清洁干燥的10 ml圆底烧瓶中, 以3 r/min的速度旋转15 min, 取旋转后的血液进行血小板计数,为粘附后的血小板数, 计算血小板粘附率［5］。

1.2.5血小板释放实验雄性SD大鼠(200～250 g 二级), 动物处理及PRP制备同血小板聚集实验。取300 μlPRP(血小板浓度为4.0×108个/ml),37℃温育1min, 加入ADP (5×10－６ moｌ/Ｌ), 诱导血小板聚集和释放反应, 5 min后加入消炎痛(1×10－５ mol/Ｌ)终止反应,反应混合物转入冰冷的离心管中, 在3*#500 r/min、 4℃离心10 min, 上清液保存于－20℃待测。用放免法测定其中的TXB2含量。

1.2.6大鼠主动脉条释放PGI2实验测定雄性SD大鼠(150～220 g, 二级), 按体重平均分为5组: 溶媒对照组、 ASA组、 DR 7.5、15和30 mg/kg组。 动物处理同1.2.2。末次给药前禁食12 h, 给药后1 h麻醉, 取出主动脉弓至腹主动脉间4cm长的动脉条,置冰浴上除去脂肪和结缔组织, 放入1 ml冰冷的K-H生理营养液中, 37℃温育30 min后, 取出动脉条,温育液于－20℃保存待用。用放免法测定其中PGI2的稳定代谢产物6-keto-PGF1α的浓度。

1.2.7出血时间测定实验雄性SD大鼠 (150～220g 二级), 按体重平均分为5组: 溶媒对照组、 肝素对照组、 DR 7.5、 15、 30 mg/kg处理组, 末次给药后50 min, 阳性对照组动物麻醉下静注肝素(200 U/kg), 10 min后与其它组动物(处理后1 h)一起麻醉,切去3mm尾尖, 用滤纸接血滴, 记录出血时间［7］。

2结果

2.1 DR对大鼠血小板聚集的影响

dR 15 mg/kg单次静脉处理后10 min 使ADP引起的血小板聚集率较溶媒对照组明显降低; DR 7.5、 15 、 和30 mg/kg(bid×3.5 d,ig), 使ADP、 胶原或凝血酶诱导的大鼠血小板聚集率较溶媒对照组均有明显降低(表1), 表明DR无论胃肠道还是静脉给药,均可抑制大鼠血小板聚集功能。

2.2 DR对家兔血小板聚集的影响

dR 15 mg/kg一次处理1 h后, 对ADP诱导的家兔血小板聚集有一定程度抑制作用, 2～6 h之间抑制作用非常明显, 8 h时血小板活性有所恢复,但仍较对照组动物相应时间点的血小板聚集活性显著降低。结果提示: DR也可抑制家兔血小板聚集功能, 其抑制作用至少可维持8 h 。

2.3 DR对大鼠血小板粘附的影响

dR 7.5、 15 mg/kg (bid×3.5 d,ig)对血小板粘附率无明显影响, 30 mg/kg可明显降低血小板的粘附率,表明DR在较高剂量也可抑制血小板粘附功能。

2.4 DR对大鼠血小板释放的影响

dR 7.5、 15 、 30 mg/kg (bid×3.5 d,ig)对ADP诱导的血小板释放无明显影响, 而ASA 30 mg/kg同样条件下可明显抑制血小板释放TXA2 。

2.5DR对大鼠主动脉段释放PGI2的影响

dR 7.5 mg/kg 对大鼠主动脉段温育液中的PGI2的稳定代谢物6-keto-PGF1α的浓度无明显影响, 15 mg/kg使6-keto-PGF1α浓度有所增加, DR 30 mg/kg明显升高6-keto-PGF1α的浓度。

2.6DR对大鼠尾出血时间的影响

dR在抑制血小板功能的剂量下似可延长出血时间, 但作用较弱, 也未表现出量效关系, 此作用明显弱于肝素。

3讨论

血小板的活化、 聚集是心肌梗塞和脑缺血性中风发病的重要诱因, 抑制血小板聚集可预防这些疾病的发生和复发。体内可引起血小板聚集的因素有多种,抑制单一因素不可能得到理想的预防效果, 因此需要有在血小板活化的不同环节的共同作用, 方可有好的效果。基于这一思路,本研究试图通过干扰纤维蛋白原受体的活化来调节血小板功能。 DR的分子结构特点与GPⅡb/Ⅲa胞浆区的α与β亚基之间的门冬氨酸和精氨酸形成的盐桥相似,有可能替代这一盐桥被水解, 而减少盐桥的破坏, 从而抑制血小板活化、 聚集。本研究结果显示: DR经静脉或胃肠道途径给药,对不同诱导剂引起的动物血小板聚集均有抑制作用, 在较高剂量也可抑制血小板粘附, DR抑制血小板聚集的同时不影响TXA2的释放,剂量稍高时可促进血管壁释放PGI2,而在相同实验条件下阿司匹林可明显抑制血小板TXA2和血管壁PGI2的释放。DR延长出血时间的作用也反映了它对血小板功能的抑制作用。结果提示, dR与阿司匹林的作用靶点不同, 其抗血小板作用机制还可能与血管内皮PGI2释放增加有关, 然而这些资料尚不足以阐明其确切机制。总之,这一结果为血小板功能的调节提供了新思路。其确切的作用机制的研究正在进行中。

参考文献

［1］徐理纳. 抗血栓药. 陈修, 陈维洲, 曾贵云主编. 心血管药理学. 第2版. 北京: 人民卫生出版社, 1997, 547～570.

［２］Labrade P, Charm C, Pilgrims F. Functional properties of lyophilized hemoglobin in the presence of amino acids after 13 months of conservation. experientia, 1981, 37:1020～1021.

［３］Pytela R, Pierschbacher MS, Ginsberg MH et al. Platelet membrane glyc