摘要：实验以两肾一夹肾性高血压大鼠为模型, 研究主动脉Gαq/11介导的细胞信号转导的变化及其意义。制备两肾一夹肾性高血压大鼠模型, 分别于术后第1、 2、4和8周测定动脉血压, 用免疫印迹法检测主动脉组织中Gαq/11亚单位和细胞外信号调节激酶 1/2 (ERK1/2)含量, 测定磷脂酶C (phospholipase c, PLC)活性。结果显示高血压组大鼠于术后第2周血压开始升高; 主动脉Gαq/11和ERK1/2含量于术后第1周增加(分别为57.53%和40.16%),并维持在高水平(P＜0.01); 术后主动脉PLC活性亦增加(P＜0.05)。实验表明, 肾素依赖性高血压能引起大鼠主动脉Gαq/11介导的细胞信号转导系统激活,并参与高血压的发生和发展。高血压及其引起的心血管并发症是严重威胁人类生命健康的疾病, 血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)异常增殖导致的血管壁增厚和血管反应性增强在高血压的发生和发展中起着重要的作用。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)可以引起在体和离体培养的VSMC增殖肥大。应用血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme, ACE)抑制剂和AngⅡ受体拮抗剂可以逆转已发生的血管壁肥厚和VSMC增殖［1～3］。 AngⅡ引起VSMC增殖的细胞信号转导机制受到国内外的普遍关注。研究表明, angⅡ受体是Gq/11蛋白耦联受体, AngⅡ与其受体结合后, 通过Gq激活PLC, 后者水解膜磷脂生成三磷酸肌醇和甘油二酯, 使胞浆内钙离子浓度升高,以及蛋白激酶C活化, 激活包括转录因子在内的多种物质, 引起VSMC肥大、 增殖［4］。近来的研究表明, AngⅡ可使培养的大鼠主动脉VSMC内细胞外信号调节激酶(extracellular signalregulated kinase 1/2, ERK1/2)活化, ERK1/2的活化可能与AngⅡ引起的VSMC肥大密切相关［5,6］。两肾一夹(twokidney one clip, 2K1C)高血压是肾素依赖性高血压, 肾素血管紧张素系统(renin angiotensin system, rAS)活化导致循环和组织局部AngⅡ含量增高。本实验采用2K1C肾性高血压大鼠(renal hypertension rat, RHR)为模型, 观察主动脉Gαq/11介导的细胞信号转导系统的动态变化及其与高血压发生、发展的关系。

1材料和方法

1.1 动物模型健康雄性Wistar大鼠(160～180 g, 由北京大学医学部试验动物中心提供), 随机分为 (1) RHR组: 乙醚麻醉下,沿腹白线作正中切口打开腹腔, 分离左侧肾动脉, 用一内径为0.25 mm的银夹使之部分缩窄; (2)假手术组(Sham): 实行同样的手术操作,但是不缩窄肾动脉, 作为对照。术后1、 2、 4、 8周分别用戊巴比妥钠45 mg/kg麻醉, 行颈总动脉插管, 记录动脉收缩压(systolic blood pressure, SBP)、 舒张压(diastolic blood pressure, DBP); 取血测定ACE活性; 取胸腹主动脉条备用。

1.2主动脉HE染色胸主动脉经福尔马林固定后用石蜡进行包埋, 沿动脉长轴垂直方向进行连续切片, HE染色,光镜下观察动脉形态学的变化。

1.3 主动脉膜蛋白及胞浆蛋白制备取主动脉置于4℃生理盐水中冲洗、 吸干, 加入裂解液(50 mmol/L TrisHCl, pH 7.2, 0.1%脱氧胆酸钠, 0.1% Triton X100, 5 mmol/L EDTA, 100 μmol/L PMSF), 制备组织匀浆, 静置30 min后1*#000g离心10 min, 收集上清液, 于20*#000g离心40 min, 分别收集上清和沉淀。用缓冲液(20 mmol/L TrisHCl, pH 7.4, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L DTT, 100 μmol/L PMSF)混悬沉淀。上述操作均在4℃下进行。以牛血清白蛋白为标准蛋白,用Lowry氏法测定胞膜和胞浆蛋白浓度。

1.4 血浆ACE活性的测定取血1 ml, 1*#800g离心15 min, 取上清0.05 ml, 加入20 mmol/L马尿酰组氨酰亮氨酸0.05 ml,37℃孵育15 min, 加入终止液和中和液后显色, 用比色法测定生成的马尿酸含量, 以1 min产生1 μmol马尿酸作为一个ACE活性单位。

1.5 免疫印迹法测定Gαq/11含量150μg细胞膜蛋白用9% SDSPAGE分离, 将蛋白电转移至硝酸纤维膜, 用5%脱脂奶粉进行非特异封闭, pBS冲洗后, 加入抗Gαq/11亚单位的多克隆抗体(Santa Cruz 生物技术公司), 4℃过夜, 0.1% TweenPBS冲洗,加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育, 冲洗后加入化学发光剂(Amersham公司)进行曝光。用LEICAQ/11550IW图像分析系统对所得区带积分光密度进行扫描。

1.6 磷脂酶C (phospholipase C, PLC)活性测定以［3H］二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2) (NEN产品)为底物测定主动脉细胞膜蛋白PLC活性［7］。反应液(70μl): 280 μmol/L 磷脂酰丝氨酸, 28 μmol/L ［3H］PIP2 (370 GBq/mol), 50 mmol/L HEPES, 2 mmol/L EDTA, 10 mmol/L 氯化锂, 3.2 mmol/L 脱氧胆酸钠, 0.5 μg 膜蛋白, 25℃孵育30 min, 加入0.5 ml氯仿/甲醇/盐酸 (500/500/3) 终止反应。加入0.15 ml含5 mmol/L EGTA的1 mol/L盐酸震荡, 14*#000g离心1 min,取上清液200 μl用WALLAC1410液闪计数仪计数, 以1 min内1 mg膜蛋白生成1 pmol磷酸肌醇作为一个PLC活性单位。

1.7 免疫印迹法测定ERK1/2含量12% SDSPAGE分离细胞浆蛋白80 μg, 将蛋白电转移至硝酸纤维膜, 用5%脱脂奶粉进行非特异封闭, pBS冲洗后, 加入抗ERK1/2的多克隆抗体(Sigma产品), 室温孵育2 h, 用0.1% PBST冲洗, 加入辣根过氧化物酶标记的二抗孵育,冲洗后以化学发光法进行曝光。用LEICAQ550IW图像分析系统对所得区带积分光密度进行扫描。

1.8 统计学处理数据用mean±SE表示。两组资料比较采用非配对t检验, 多组资料比较采用Oneway ANOVA分析,组间比较采用q检验。P＜0.05表示差异具有显著性, P＜0.01表示差异具有高度显著性。

2结果

2.1 动脉血压的变化

rHR术后1周动脉收缩压无明显变化, 术后2、 4和8周分别较假手术组增高16.5%、36.3%、35.6%(P＜0.01)。动脉舒张压的升高趋势与收缩压相同。结果显示, 2K1C大鼠在术后2周开始发生高血压。

2.2 动脉HE染色结果

rHR术后1周即见主动脉重构的发生, 表现为弹力板弯曲, 中层平滑肌细胞的细胞核密集, 核深染、 体积增大,核的方向与平滑肌细胞的长轴垂直。术后2至8周上述表现更加明显, 同时可见弹力板之间平滑肌细胞层数明显增加, 提示平滑肌细胞增殖肥大。

2.3 血浆ACE活性

rHR组1、 2、 4周的血浆ACE活性均较假手术组显著性升高(P＜0.01), 分别增加56.6%、 93.3%和99.6%;8周时与假手术组相比无显著性差异, 表明RHR术后1至4周机体RAS明显激活, 而在术后8周时降至对照水平。

2.4 主动脉Gαq/11亚单位含量

免疫印迹分析结果经积分光密度扫描证实, RHR术后1周主动脉Gαq/11亚单位含量已经升高, 术后2、 4和8周RHR分别较同龄假手术组增加69.04%、51.83%和54.14% (P＜0.01), 表明肾性高血压可以引起Gαq/11上调, 且时间早于动脉血压升高。

2.5 主动脉PLC活性

测定RHR术后4和8周主动脉Gαq/11下游信号分子的PLC活性, 发现RHR组PLC活性均较同龄假手术组显著增高, 表明主动脉Gαq/11上调的同时,其介导的下游信号分子亦活化。

2.6 主动脉ERK1/2含量

免疫印迹分析结果见图3a。RHR术后1周主动脉ERK1/2含量已经比假手术组升高, 术后2、 4和8周主动脉ERK1/2含量分别较同龄假手术组增加27.4%、23.1%和48.4% (P＜0.01), 表明肾性高血压可引起胞浆内信号分子ERK1/2上调。

3讨论

高血压的发病机制与多种因素有关, 许多研究表明Ang Ⅱ、 ET1等能够导致VSMC的肥大、 增殖［8］, 使血管反应性改变,血管壁增厚。但对它们受体后的信号转导通路的改变并不清楚, 特别是对将细胞外信号转换成为细胞内信息分子活动的关键信息分子Gq/11蛋白的研究甚少。本研究采用发病原因明确、因RAS激活所致高血压的动物模型,以主动脉Gαq/11、 PLC、 ERK1/2为研究对象, 探讨肾素依赖性高血压中Gq/11蛋白介导的信号转导通路的变化及其病理生理意义。

本实验大鼠2K1C术后2周动脉血压开始升高, 于4周达到稳定并持续在高水平, 这与文献中采取同样体重、 同样内径银夹缩窄所得结果相符［9］。2K1C RHR术后1～8周为肾素依赖性阶段,循环RAS激活使血浆中肾素和AngⅡ浓度增高导致血压升高, 而此后血压升高主要是容量依赖性阶段, 这时循环RAS活性已降至对照水平,血压由于钠水潴留及血管局部RAS活化得以维持在高水平［9］。我们的结果显示, 大鼠2K1C术后1～4周血浆ACE活性均较对照升高, 8周时降至对照水平,与文献报道一致, 说明我们成功地复制了肾素依赖性高血压大鼠模型。

动脉血压的升高是否伴有主动脉细胞内Gαq/11介导的信号转导通路的变化？这种变化与动脉血压的升高是否存在着一定的因果关系？本研究对2K1C RHR主动脉Gαq/11蛋白含量的动态观察发现, gαq/11于2K1C术后1周发生上调并维持在高水平, 同时其功能也增强, 催化其下游的信号分子PLC活性增高, 表明肾素依赖性高血压大鼠中, 主动脉Gq/11蛋白介导的信号转导通路处于激活状态,并且这种活化先于动脉血压的改变, 这提示主动脉中Gαq/11蛋白的表达及功能上调不是高血压作用的结果,而是影响血压调节的因素。Gαq/11水平的这种改变并不是在所有高血压中都存在。有学者对肾切除所致高血压大鼠、 米兰遗传性高血压大鼠和盐敏感高血压大鼠的研究发现,这些高血压动物模型中主动脉Gαq/11含量没有改变［10～12］。缩窄大鼠两肾动脉分支之间的腹主动脉, 造成右侧肾脏缺血, 同样可以导致动物的血压升高,对其主动