摘要：为探讨5-羟色胺(5-HT)对过量谷氨酸(glutamate, Glu)神经毒性的影响, 观察了5-HT存在时, 过量Glu对海马细胞存活率、海马脑片CA1区群锋电位(population spike, PS)及神经细胞膜Ca2+电流的影响。结果发现: 5-HT可明显提高过量Glu作用下海马神经细胞的存活率,减缓Glu对海马脑片CA1区PS的降低作用; 在细胞膜上, 5-HT可明显减弱Glu诱导的Ca2+内向电流。推测, 一定浓度的5-HT具有抑制过量Glu神经毒性的作用,其机制可能在于5-HT与细胞膜上特定的受体结合, 抑制了Glu诱导的Ca2+内流。临床报告和动物实验均表明, 长期反复的心理应激影响脑功能, 使学习记忆能力和行为能力降低。进一步的研究证实, 应激时体内急剧升高的应激激素糖皮质激素 (glucocorticoids, gCs), 是应激影响脑功能的主要原因之一。研究发现, 高浓度的GCs会选择性地作用于与学习记忆功能密切相关的海马脑区, 影响海马的正常功能,甚至导致海马神经元发生不同程度的萎缩, 乃至死亡［1］。

已有的研究表明, GCs作用于海马神经元的主要机制之一, 是通过谷氨酸(glutamate, Glu)作用于细胞。过量的GCs会使Glu在细胞外大量聚积,产生兴奋性神经毒性［2］。研究证实, 突触间Glu的大量聚积, 会激活神经细胞膜上特异的受体通道, 使胞外Ca2+大量内流, 胞内Ca2+聚积, 导致细胞损伤、死亡［2］。

有研究报道, 应激引发GCs和Glu升高的同时, 还影响海马的5-HT系统。长期处于应激状态不但使海马5-HT含量、 5-HT受体发生改变,而且使投射到海马的5-HT能神经的传递能力下降［3］。海马5-HT系统失衡是应激导致抑郁症和焦虑症发病的主要原因［7］。

进一步的研究发现, 提高 5-HT 能神经传递能力、抑制突触回收5-HT的药物, 可有效地减弱应激对海马的损伤作用［8］。分析其原因, 有学者认为,突触间5-HT与其受体结合产生的效果可能具有拮抗Glu与其受体结合产生的效应, 即会减弱过量Glu的神经毒性［4］。但目前, 有关5-HT拮抗过量Glu神经毒性的推测尚缺少充分的实验证据,为此, 本研究就5-HT影响过量Glu神经毒性的作用及机制进行了初步探索。

1材料和方法

1.1 体外原代培养大鼠海马神经细胞新生Wistar乳鼠 (军事医学科学院动物中心提供)断头取海马→胰酶 (0.125%)消化→种植液洗涤,稀释成106个/ml细胞悬液→种植入96孔培养板 (100 μl/孔)→CO2培养箱中培养→24 h, 换无血清饲养液→48 h,加阿糖胞酐抑制胶质细胞生长→换饲养液后第5 d, 培养液中加Glu (10、 50、 100 μmol/L)或5-HT (10－５ μmol/L)→48 h,观察其结果。

种植液组成: DMEM (84%)、 马血清 (10%)、 胎牛血清 (5%)、 谷氨酰胺 (1%)。

无血清饲养液组成: neurobasal medium (98%)、 N2 (1%)、 谷氨酰胺 (1%)。

1.2细胞存活率的测定MTT染色法: 96孔培养板每孔加入10 μl甲基-噻唑蓝 (methyl thiazolyl, MTT)磷酸缓冲液(终浓度为0.5 mg/ml), 培养5h后, 吸出培养液, 加入DMSO 100 μl/孔, 振荡, 使结晶充分溶解; 最后在酶标仪上测量光密度(激发波长: 570 nm)。

1.3 大鼠海马脑片制备雄性Wistar大鼠(军事医学科学院动物中心提供), 体重100 g左右, 乙醚快速麻醉。断头, 迅速取出脑组织, 放入通有95% o2和5%CO2混合气的冰冷的人工脑脊液(ACSF)中。冰浴下迅速取出海马组织, 在振动切片机上, 垂直于海马纵轴方向切取海马脑片, 脑片厚度为200 μm。将脑片放入通有95%O2和5%CO2混合气、温度为31℃的ACSF中, 孵育1～2 h待用。

1.4 海马脑片CA1区群锋电位(PS)的诱发将孵育过的脑片放入脑片浴槽中, 用31℃、 含95%O2和5%CO2混合气的ACSF全浸灌流, 灌流速度为2 ml/min。将双股不锈钢刺激电极置于海马脑片的Schaffer侧枝通路上, 记录玻璃微电极置于CA1区的锥体细胞层上。

用间隔60 s、 时程100 μs、 电流强度0.5 mA的电刺激, 刺激Schaffer通路, 记录的PS电信号经放大器放大、计算机采样处理。至少维持30 min, 待PS波形稳定, 以此时PS幅度为100%。之后, 换用含Glu 1.0 mmol/L (或同时含5-HT 10－５ mol/L和Glu 1.0 mmol/L)的ACSF灌流脑片, 记录每分钟PS的幅度变化 (百分数表示)。

1.5海马细胞膜Glu配体依赖性Ca2+电流的测量在正常培养海马神经细胞的35mm培养皿中, 弃培养液, 换记录液 (含5-HT 10－５ mol/L或0)。采用膜片箝 (patch clamp)全细胞记录法, 将细胞膜电位箝制在－40 mV, 用100 μmol/L的 Glu喷射到细胞膜上,测量Ca2+电流。

记录液成分: NaCl 140 mmol/L、 KCl 5 mmol/L、 HEPES 10 mmol/L、 Glucose 10 μmol/L、 CaCl22 mmol/L、 TTX 1 μmol/L、 Gly 10 μmol/L。

电极内液成分(mmol/L): CsCl 140、 HEPES 10、 EGTA 10、 Na2ATP 2。

1.6 数据处理细胞存活率以对照组为100%, 其它实验组与之比较, 用百分数表示。海马脑片PS幅值大小以Glu灌流前5min内的均值为100%,其它时间点的PS与之比较, 用百分数表示。数据结果表示为mean±SD, 用柱图或线图表示。两组数据比较用t检验。

2结果

2.1 5-HT对过量Glu神经兴奋性毒性的影响

过量的Glu有明显的神经毒性作用。10、 50和100 μmol/L 的Glu作用48 h, 可明显降低海马神经元的存活率 (P＜0.01),且有剂量依赖关系。

当培养液中含有5-HT (10－５ mol/L)时, 同样在过量的Glu作用下, 海马神经元的存活率提高, 其中对100 μmol/L Glu毒性的抑制作用更为明显(P＜0.05)。可见, 一定浓度的5-HT具有抑制Glu的兴奋性毒性作用。

2.2 5-HT对海马脑片过量Glu神经毒性的影响

用含1 mmol/L Glu的ACSF灌流海马脑片, 会使CA1区诱发的PS幅值在2～3 min内迅速下降, 表明Glu对海马生理机能有明显的毒性作用。而当灌流液中含有5-HT(10－５ mol/L)时, 同样在Glu (1 mmol/L)作用下, PS下降会明显减缓。在Glu单独作用下, PS在2～3 min内降到10%以下,而在5-HT存在时, PS的降低速率延迟, Glu作用约10 min时, PS才降到10%以下, 表明5-HT有明显减缓过量Glu神经毒性的作用。

2.3 5-HT对海马神经细胞膜上Glu诱导的Ca2+电流的影响

100 μmol/L的Glu在海马神经细胞膜上诱导的内向Ca2+电流为1*#070 pA左右; 当记录液中含有10－５ mol/L的5-HT时, 相同浓度Glu诱导的Ca2+电流则减弱到470 pA左右, 两组数值差异显著 (P＜0.01)。可见, 5-HT减弱Glu诱导的Ca2+电流, 可能是5-HT抑制过量Glu神经毒性的机制之一。图4是在海马神经元上诱发的Ca2+电流。

3讨论

神经细胞膜上与Glu结合的主要受体NMDA受体, 是电压-配体双重依赖的受体Ca2+通道, 在细胞膜去极化达一定程度和胞外Glu联合作用下, NMDA受体会被激活, ca2+通道开放。

已有的研究表明, 糖皮质激素损伤海马神经细胞主要通过两种途径: 降低细胞能量代谢水平和使Glu在胞外大量聚积［9］。分析认为,由于GCs抑制了海马神经元正常的能量代谢, 使其能量匮乏, 可能会导致神经细胞膜上Na+·K+-ATP酶功能下降, 造成细胞膜去极化［10］, 使NMDA受体的激活得到易化;同时, 在细胞外大量聚积的Glu的共同作用下, 会大量激活神经细胞膜上的NMDA受体, 导致大量的Ca2+内流, 引起胞内Ca2+蓄积、 超载,最终导致神经细胞损伤［11］。

研究发现, 应激还会影响海马的5-HT系统。慢性应激会使海马5-HT水平低下,同时也使5-HT1A受体的功能和水平下降。由于5-HT与5-HT1A受体结合具有保护海马、 益于海马正常功能发挥的作用, 所以,应激对海马5-HT水平和5-HT受体的改变, 可能会使海马神经元在有害因素作用下易受损性大大增加［7］。

从本研究在正常海马脑片和细胞上的实验结果推测, 5-HT抑制过量Glu神经毒性的作用机制, 可能主要是5-HT结合5-HT1A受体的作用所致。已有研究证实,5-HT与5-HT1A受体结合会使细胞膜上的K+内流增加, 膜超极化, 从而达到抑制NMDA受体开放, 减弱过量Glu诱导的Ca2+内流的作用［7］。

总之, 本研究通过实验初步得出, 提高5-HT的水平, 具有抑制过量Glu神经细胞毒性, 减缓过量Glu损伤海马机能的作用。虽然该实验只改变了5-HT的含量,并未涉及5-HT受体的变化, 但仍然得到了阳性的结果。该结果对应激损伤干预措施的提出可能具有一定的借鉴意义。本研究还有待在5-HT受体、 5-HT抑制过量Glu神经毒性机制等方面做更加深入的研究。

参考文献

[1] Sapolsky RM, Why stress is bad for your brain. Science, 1996, 273:749～750.

［２］Moghaddam B, Bolinao ML, Stein-Behrens B et al. Glucocorticoids mediate the stress-induced extracelluar accumulation of glutamate. Brain Res, 1994,655:251～254.

［３］Amat J, Matus-Amat P, Watkins LR et al. Escapable and inescapable stress differentially and selectively extracelluar levels of 5-HT in the ventral hippocampus and dorsal periaqueductal gray of the rat． Brain Res, 1998,797:12～22.

［４］McEwen BS. Prevention of stress-induced morphological and cognitive consequences<