第四军医大学学报2000年第21卷第1期

鲍岚林英华张旭

摘要：目的对大鼠冠状血管中神经肽Y(NPY)的Y₁受体样免疫反应物质(-LI)进行定位.方法用免疫组织化学方法在光镜和电镜水平进行观察.结果大鼠心脏内大的冠状动脉未见Y₁受体免疫反应的(-Ir)标记，小动脉和微动脉的多数平滑肌细胞则含Y₁受体-LI.小动脉和微动脉平滑肌细胞的Y₁受体-LI在血管外膜侧、内皮细胞侧和两个平滑肌细胞相邻侧的细胞膜上均有散在的Y₁受体-LI和Y₁受体-Ir小泡，一些毛细血管的内皮细胞呈Y₁受体-LI.结论NPY对冠状血流的调节主要作用于小动脉和微动脉的平滑肌细胞，有些毛细血管的内皮细胞可能也参与NPY对血流的调节.

关键词：受体；神经肽；冠状血管；超微结构；大鼠

0引言

冠状血管周围有神经肽Y(NPY)免疫反应(Ir)神经纤维分布，在人^［1］和大鼠^［2］等的冠状动脉观察到NPY有较强的收缩作用，且冠状动脉的末稍支远较其心外膜支敏感，冠状动脉内注射NPY仅引起心外膜支很小的血管直径造影变化，但明显地增加血管阻力，NPY对冠状血管收缩作用主要位于小动脉^［3］，且直接作用于血管平滑肌^［4］.

通过放射自显影配基结合方法观察到心脏有NPY的Y₁受体的结合点^［5］，用分子原位杂交方法也观察到人体心脏中有表达Y₁受体的mRNA^［6］.但由于已往的检测方法对组织定位的精确性不够，无法在细胞水平精确地确定受体的位置.1994年张旭等^［7］首次制备成功了抗Y₁受体C末端肽片段的抗体，并在此基础上得到纯化的抗血清.我们用这种抗Y₁受体抗体，在光镜和电镜水平上，用免疫组织化学方法研究了Y₁受体在大鼠冠状血管中的分布.

1材料和方法

1.1免疫组织化学方法10只SD大鼠(200～250 g)(本校实验动物中心提供)，戊巴比妥钠麻醉(50 mg·kg^-1, ip)，经心脏灌注37℃生理盐水50 mL和37℃ 40 g·L^-1多聚甲醛固定液50 mL(用磷酸缓冲液配制)，再灌注4℃同样固定液250 mL，取心脏，放入4℃同样固定液后固定1.5 h，200 g·L^-1蔗糖浸泡24 h以上，用冰冻切片机(Leica,德国)切20 μm的心脏矢状和冠状切片.根据免疫组织化学方法进行组织处理，将切片放入抗Y₁受体C末端肽片段的纯化的兔抗血清(1∶8000)^［7］中，用生物素标记的羊抗兔血清(1∶200)和Vector aBC盒(Vector 实验室，美国)孵育，用二甲基联苯胺和硫酸镍胺加强法显色，干燥，透明，DPX封片.在显微镜下观察标本，Leica图像处理系统(Leica, 德国)取像.

1.2包埋前免疫电镜组织化学方法4只SD大鼠，麻醉同上，经心脏灌注37℃生理盐水50 mL和37℃含0.5 mL·L^-1戊二醛和40 g·L^-1多聚甲醛磷酸缓冲液50 mL，再灌注4℃同样固定液250 mL，取心脏，放入4℃同样固定液后固定2 h，切50～100 μm振动切片. 在200 g·L^-1蔗糖磷酸缓冲液中浸泡3 h后，在液氮中冻融3次将切片放入抗Y₁受体C末端肽片段的兔抗血清(1∶8000)^［7］中，用生物素标记的羊抗兔血清(1∶200)和Vector aBC盒(Vector实验室，美国)孵育，进行常规DAB反应，产物呈棕色.在10 g·L^-1锇酸中处理30 min，经梯度乙醇和环氧丙烷脱水后，在Epon812中浸润，做平板包埋，聚合后在光镜下定位，取材，在LKBⅢ超薄切片机上做超薄切片，在JEOL-100SX电子显微镜下观察，拍照.

1.3免疫组织化学对照实验将用以制备抗体的合成Y₁受体片段1μmol·L^{-1 ［7］}与Y₁受体抗血清混合，放置20 h后，做免疫组织化学结合吸收试验，以鉴定血清的特异性.

1.4免疫组织化学标记强度测定用Leica-Q570C型图像处理系统测定大鼠心脏矢状切片中动脉Y₁受体免疫反应阳性强度，同时测定血管横断面经血管中心的长内径和短内径，根据血管的长内径和短内径换算出血管的直径，将血管依大小进行分组，每一血管组测6～7血管断面.所给的Y₁受体-Ir强度百分比为该血管断面Y₁受体-Ir灰度水平与同一张切片中测定的大冠状动脉(280～300μm)灰度水平的百分比值减去100%.

1.5原位杂交Y₁受体寡核苷酸探针序列为Y₁受体cDNA的第546～586核酸的反向互补序列，用α-³⁵S-αATP(New England Nuclear, 波士顿，美国)、脱氧核酸末端转移酶(Amersham,英国)、10 mmol·L^-1 CoCl₂、1 nmol·L^-1二硫苏糖醇(LKB, bromma, Sweden)、300 Tris和1.4 mol·L^-1二甲胂酸钾(pH7.2)反应体系标记探针的3端. 被标记的探针经Nensorb-20柱(New england Nuclear, 波士顿，美国)纯化后，加入10 mmol·L^-1二硫苏糖醇，得到标记比活性为(17～67)×10³ bq·ng^-1寡合核苷酸.

SD大鼠2只，麻醉同上，断头，快速取出大鼠心脏，在干冰上快速冷冻，用冰冻切片机切厚为14μm的切片，贴于原位杂交专用的载玻片上(Fisher, Pittsburg, PA, uSA). 切片经干燥后，在42℃的湿盒内用含0.5～1 ng标记探针杂交液孵育16～18 h，杂交液每100 μL 包括下列物质：500 g·L^-1甲酰胺(GT baker Chemicals, Deventer, Netherlands); 4×SSC(1×SSC=0.15 mol·L^-1 naCl和0.0015 mol·L^-1枸橼酸钠)；1×Denhardt溶液(0.2 g·L^-1 each of polyvinylpyrrolidone,牛血清白蛋白和聚蔗糖)；10 g·L^-1 sarcosyl (N-十二烷基肌胺酸, sigma, St. Louis, MO, USA); 0.02 mol·L^-1磷酸缓冲液(pH7.0)；100 g·L^-1右旋糖苷硫酸盐(Pharmacia, Uppsala, sweden); 500 mg·L^-1剪切和加热变性的鲑鱼睾丸DNA(Sigma); 200 mmol·L^-1二硫苏糖醇. 杂交后在55℃的1×SSC(4×15 min)和蒸馏水中清洗，600 mL·L^-1和900 mL·L^-1乙醇中脱水，凉干.片子浸入用蒸馏水1∶1稀释的NTB2核迹乳剂(Kodak, Rochester, NY, uSA)中，然后在-20℃的暗室内放4～6 wk，显影和定影，在显微镜暗视野下观察，拍照.

1.6原位杂交对照实验用未经³⁵S标记的探针和³⁵S标记探针100∶1混合作为杂交液孵育切片，其余步骤同上.得到阴性对照实验结果.

2结果

2.1不同管径的冠状动脉中Y₁受体分布大鼠大的冠状动脉分支(直径＞280μm)未检测到Y₁受体-LI (Fig 1).而小动脉和微动脉有许多平滑肌细胞含高水平的Y₁受体-LI(Fig 2，3)，Y₁受体-Ir血管平滑肌细胞呈单层，围绕血管长轴分布，Y₁受体-LI主要集中于细胞膜附近，可见少量Y₁受体阴性平滑肌细胞不规则地出现在Y₁受体阳性平滑肌细胞之间(Fig3，4). Y₁受体-Ir标记强度随动脉直径的减小而增加(Fig5)，强度最高为直径10～30 μm的微动脉(Fig 2). 心房与心室血管Y₁受体-Ir分布无明显差异.

图1心脏大冠状动脉未见Y₁受体-Ir标记

fig 1Y₁-R-LI was not detected in the cross section of the large coronary artery (the largest inner diameter=485 μm, the shortest inner diameter=171 μm). *The lumen of the blood vessel, Bar=40 μm

图2心室微动脉横断面有丰富的Y₁受体-Ir标记

fig 2High Y₁-R-LIs (arrowhead) were detected in the cross section of the ventricle arteriole *The lumen of the blood vessel. Bar=30 μm

图3含丰富的Y₁受体-Ir微动脉，Y₁受体-Ir阳性平滑肌细胞和Y₁受体阴性平滑肌细胞相间出现

fig 3Distribution of Y₁-R-LI in an arteriole. Y₁-R-positive sMC (one arrowhead) were interspersed with Y₁-R-negative SMCs (two arrowheads). Bar=30 μm

图470 μm切片中Y₁受体-Ir微动脉，Y₁受体阳性平滑肌细胞与Y₁受体阴性平滑肌细胞相间出现

fig 4Y₁-R-Ir arteriole of 70 μm sect