第二军医大学学报2000年第21卷第3期

窦鸿李民毛积芳陈常庆

摘要目的：高密度、高表达培养重组大肠杆菌TG1/pGEX-hCT，生产重组人降钙素(rhCT)。方法和结果：应用NBS bioFlo 3000 型5 L自控发酵罐，采用分批培养和补料分批培养相结合的培养技术，控制碳源和氮源的补加，控制溶解氧，使重组菌E. coli TG1/pGEX-hCT发酵光密度［D(600)］达到58.6，人降钙素和GST融合蛋白(GST-hCT)的含量达到3.2 g/L。结论：本研究为工业化生产重组hCT奠定了基础。

关键词：降钙素；表达

降钙素(calcitonin)是一个32肽的激素，是由哺乳动物的甲状腺或爬行类和鸟类的后腮旁腺的C细胞分泌的，在调节钙和磷酸盐代谢中起非常重要的作用，能够预防和治疗高血钙症、骨质疏松症。鲑鱼以及人的降钙素(hCT)已经在大肠杆菌中获得了表达。Gigova等^［1］采用重复基因表达的多聚hCT，进行了10 l的发酵研究，结果最高产量仅达到44～100 mg/L。Ray等^［2］也报道了采用GST融合系统生产降钙素的工艺，10 l发酵的最终光密度［D(600)］只有14，生产率都较低。Yabuta等^［3］虽成功地应用了高密度发酵技术，使一系列表达hCT重组菌的发酵光密度［D(600)］达到53～120，但是得到的重组蛋白是包涵体。我们曾报道了hCT的克隆和表达^［4］，本研究在此基础上进行了高密度、高表达发酵的研究，为重组hCT的工业化生产创造条件。

1材料和方法

1.1菌株和质粒宿主大肠杆菌E.coli TG1 (sup E hsd Δ5 thi Δ(lac-proAB) f′traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15)由中科院典型培养物保藏委员会基因库提供。重组质粒 pGEX-hCT由第二军医大学生化教研室提供，hCT的基因融合在GST的 c 端，受tac启动子的控制，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）能诱导GST-hCT融合蛋白的表达。用该质粒转化宿主菌TG1得到表达hCT的工程菌株E.coli tG1/pGEX-hCT，试管培养中GST-hCT融合蛋白的表达量为28％。

1.2培养液LB培养液用作试管种子培养，含2%甘油的2-YT培养液用作二级种子培养，半合成培养液用于发酵罐中补料分批培养。LB培养液和2-YT培养液配方见参考文献［5］；半合成发酵培养液中含有(g/L)：polypepton5, yeast extract 5,甘油 10，KH₂PO₄ 2，K₂HPO₄4，Na₂HPO₄*12H₂O 7，(NH₄)₂SO₄1.2，NH₄Cl 0.2， MgSO₄*7H₂O 1和微量元素溶液，该溶液中含有(g/L)：MnSO₄*5H₂O0.001，CoCl₂*6H₂O 0.004，Na₂MoO₄*2H₂O0.002，ZnCl₂ 0.002，CuSO₄*5H₂O 0.001， H₃BO₄0.0005， FeSO₄*7H₂O 0.02， CaCl₂*2H₂O0.02；补料基质中有(g/L)：甘油170，yeast extract 71，polypepton 71，MgSO₄*7H₂O5.7。

1.3菌种的制备菌种的培养按照参考文献［6］。

1.45 L发酵培养在发酵罐中接150 ml三角瓶二级种子，罐中的起始工作体积为2.5 l。控制的几个关键参数为：溶氧及转速。空气流速设定为每分钟一个发酵体积，搅拌转速控制和溶解氧参数相关联，自动升高或降低10 r/min，使溶解氧控制在35%左右，达到最大转速800 r/min后，自动通入纯氧。

1.5补料的流加在进行5 h的分批培养后，将补料的流加分两个阶段进行，发酵过程中5～10 h期间补加进去含50 g甘油的补料，流速设定为100 ml/h；10～15 h加入含100 g甘油的补料，流速为200 ml/h。pH设定为7.0，自动流加30％的氨水保持pH稳定；温度设定为37℃；各数据由微机自动收集和记录。

1.6菌体浓度、GST-hCT融合蛋白表达量的测定、菌体总蛋白的测定菌体浓度的分光光度测定波长为600 nm，使用BioRad灰度扫描仪测定电泳条带中目的融合蛋白的含量，菌体总蛋白的测定按BradFord染料法，详见文献［7］。

2结果

2.1降钙素试管培养诱导时间的优化考察诱导持续时间可以了解外源蛋白在菌体内表达和积累的情况，并据此判断高密度发酵结束的时间。因为重组菌在诱导后，大量的能量会消耗在外源蛋白的表达上，使细菌的生长提前进入衰亡期，不及时收获会造成溶菌。在试管培养中，加入0.1 mmol/L IPTG诱导后每隔0.5 h取样分析外源蛋白的表达情况，结果表明诱导2 h后，表达水平不再提高，5 h后GST-hCT融合蛋白的表达水平有所下降(图1)，菌体密度也开始下降，因此发酵结束时间可以在诱导后的2～4 h，控制在菌体密度开始下降前。

图1IPTG诱导时间对GST-hCT表达水平的影响

fig 1Effects of IPTG induction duration on

expression of GST-hCT

lane 1～11:Induction 0.5～5.5 h

2.2诱导时IPTG浓度对外源蛋白表达水平的影响在试管培养至对数生长中期［D(600)=0.6］，加入IPTG至0.01,0.05, 0.1, 0.5, 1 mmol/L不同的终浓度，培养 3 h，最终菌体光密度为1.244，取样用SDS-PAGE检测。结果表明0.01 mmol/L的IPTG就足以诱导启动子完全开放，GST-hCT的表达量和1 mmol/L浓度的IPTG诱导效果相同。考虑到高密度发酵中菌体浓度比试管中高出几十倍，因此要加大诱导剂的强度，结合我们的实际经验，本研究采用1 mmol/L的IPTG。

2.35 L发酵罐中E. coli TG1/pGEX-hCT的高密度、高表达培养发酵过程pH控制在7.0左右，溶解氧在35％左右，转速在7 h左右达到 800 r/min，开始供应纯氧。分批培养5 h后菌体光密度达到6，随后进入10 h的补料培养阶段，菌体生长了近10倍。37℃培养至12 h，加入1 mmol/L IPTG诱导，3 h后菌体的比生长速率明显减小，生长趋势开始减缓，故终止发酵(图2)。最终菌体密度为58.6，相当于23.4 g (DCW)/L，重组蛋白的表达量为28％，融合蛋白含量3.2 g/L。

图2高密度发酵过程中 E. coli TG1/pGEX-hCT生长曲线和比生长速率

fig 2E. coli TG1/pGEX-hCT growth curve and specific

growth rate during high cell density fermentation○: Cell density; ■: Specific growth rate; Arrow

indicates the induction time

诱导后每隔0.5 h取样分析重组蛋白的表达水平，表达SDS-PAGE(图3)，可见在IPTG加入2 h后，融合蛋白的表达量达到了26％，因此外源蛋白的表达主要集中在2～3 h之间(图4)。

图3GST-hCT表达的SDS-PAGE电泳图

fig 3Electrophotogram of SDS-PAGE of

gST-hCT expression

lane 1～6: GST-hCT expression after induction 0.5～3 h

图4E. coli TG1/pGEX-hCT诱导后GST-hCT表达量与诱导时间的关系

fig 4Relationship between GST-hCT expression and

induction time of E. coli TG1/pGEX-hCT

3讨论

在影响外源蛋白表达的诸多因素中，保证细菌代谢产生的有害物质(主要是乙酸)的低含量^［6］以及诱导表达时细菌的旺盛生理状态^［7］是最为重要的，我们采取的控制养料的流加、保持溶解氧和在对数生长期进行诱导是高密度、高表达发酵取得成功的关键。

高密度发酵技术能够减少培养体积、强化下游分离提取、缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本。微生物的培养按方式不同可分为分批培养、分批补料培养和连续培养3种。传统的分批发酵技术所能得到的菌体密度很低，究其原因是培养过程中营养物质的消耗和有害代谢产物的积累，导致菌体生长速率的降低。连续培养技术通过不断补充新鲜的培养液，同时以同样的速率将培养液从反应器中抽出，消除有害代谢产物对生长的抑制作用，但是也导致培养液成分未充分利用和有用培养物的流失，且由于培养时间长易发生染菌和质粒的丢失。分批补料培养技术则是在培养过程中不断补充培养液，使菌体在较长时间内保持较高的生长速率，从而达到高密度。重组大肠杆菌发酵密度目前可以达到100 g(DCW)/L^［6］，我们以往的高密度发酵研究也达到了100［D(600)］以上，但这往往是以