第三军医大学学报2000年第22卷第7期

彭曦谭银玲陶凌辉王凤君赵云王裴尤忠义汪仕良

摘要： 目的研究肠三叶因子(ITF)及其mRNA在大鼠肠道的分布规律。方法采用原位杂交、免疫组化等手段观察了ITF及ITF mRNA在大鼠肠道的表达并使用高效液相色谱仪检测了不同肠段ITF的含量。结果从十二指肠至结肠均有ITF及ITF mRNA表达，主要分布于肠绒毛杯状细胞，其中ITF mRNA仅在杯状细胞的基底和边缘表达，其它区域的杯状细胞则呈ITF mRNA阴性反应，同时发现部分其它部位的肠上皮细胞中亦有少量ITF及ITF mRNA表达。ITF定量分析显示，整个肠道中以十二指肠含量最高，空回肠次之，结肠含量较低，各段小肠中ITF含量差异不显著(P＞0.05)，但都明显高于结肠(P＜0.01)。结论杯状细胞是合成ITF的主要场所，ITF在肠道分布的差异可能同各肠段分泌的粘液性质不同有关。

关键词：肠三叶因子；肠道；大鼠

肠三叶因子(Intestinal trefoil factor,ITF)属三叶肽家族，是一种新型的生长因子类多肽物质，1991年由Suemori^［1］首先发现并命名。生理状况下ITF存在于哺乳动物的多种组织中，但主要分布于肠道，ITF具有很强的细胞保护作用，可明显减轻多种损伤因子介导的肠粘膜损害^［2］。ITF的生理功能主要体现在两个方面：首先，ITF由于其分子结构的特殊性，可同粘液糖蛋白结合，形成牢固的复合物，对肠道粘液层起固定和支持作用，防止有害物质对肠粘膜细胞的损伤^［3］。其次，ITF具有很强的促进细胞增殖与移行的能力，可促进受损区域上皮细胞重建并加快上皮细胞移行速度^［4］。因而ITF在肠道的自我保护机制中占据重要地位。由于ITF发现不久，目前国内尚未见报道，国外文献又多集中于ITF与消化道溃疡和肿瘤的关系，而对ITF在不同肠段分布规律的研究不多。因此本研究将对ITF及其mRNA在大鼠肠道中的分布规律进行初步研究，以期阐明ITF保护肠粘膜的作用机制。

1材料与方法

1.1材料含有rITF cDNA的质粒由美国佛罗里达大学Thompson博士惠赠，rITF由丹麦NOVO研究院L.Thim教授惠赠，质粒提取盒，地高辛cRNA探针标记盒，内切酶XhoⅠ，T₃RNA聚合酶均购自德国宝灵曼公司，三氟乙酸购自德国MERCK公司，PEAE-Sephadex a-50购自Sigma公司，Hypersl C₄柱由大连国家色谱中心提供，羊抗兔抗血清由深圳晶美公司提供。

1.2方法

1.2.1肠粘膜ITF mRNA表达的检测

1.2.1.1ITF质粒转化将含有rITF cDNA的质粒接种于菌种DH5α中，质粒提取按说明书操作。

1.2.1.2ITF质粒线性化质粒经转化和提取后，在Eppendorf管内依次加入ITF质粒15μl，10×Buffer 3 μl，内切酶XhoⅠ 3 μl(20 U/μl)；ddH₂O 9 μl，混匀后于37°C 2 h。电泳观察，如只有1条带，约3.1 kb，表示酶切完全，可以终止酶切反应，如不只是1条带，说明酶切不完全，需延长酶切时间，必要时再加适量的内切酶，1～2 h后再进行电泳分析，直至酶切完全为止。

1.2.1.3探针制备及标记按地高辛cRNA探针标记盒说明书进行ITF探针标记。

1.2.1.4原位杂交健康成年Wistar大鼠6只(第三军医大学野战外科研究所动物室提供)，体重190～220 g，雌雄不拘，活杀大鼠取各部位肠段约0.5 cm，4%多聚甲醛固定，冰冻切片(20μm)，其余步骤按常规操作进行^［5］，原位杂交阴性对照：①杂交前切片用RNase20 μg/ml 37 °C处理30 min，②杂交液中不加标记探针。

1.2.2ITF免疫组织化学染色

1.2.2.1ITF抗血清的制备新西兰大白兔3只，体重2～2.5 kg，单笼饲养1周后用于实验。首次免疫：ITF按330μg/只与1 ml完全福氏佐剂混合乳化后，在腹股沟及颈部作多点皮下注射。4周后加强免疫1次，2周后再进行第2次加强免疫，注射剂量同首次免疫。第2次加强免疫后10 d开始检测是否有抗体产生，效价稳定后，颈动脉放血，收集血清，PEAE-Sephadex a-50纯化IgG，测定效价，冷冻干燥。

1.2.2.2肠组织ITF免疫组化染色活杀大鼠取各部位肠段约0.5 cm，置10%福尔马林液中固定。常规石蜡包埋切片，一抗工作浓度为1∶32，其余步骤及阴性对照按常规操作进行^［5］。

1.2.3肠粘膜中ITF含量的测定

1.2.3.1色谱条件Hypersil C₄柱，300 A， 10 μm,250×4.6 mm；流动相：A=10%乙腈-三氟乙酸(0.1%)，B=60%乙腈-三氟乙酸(0.1%)。线性梯度洗脱，10%～90%B；流速：1 ml/min，全程40 min；检测波长：UV214 nm，灵敏度：0.005 AUFS,进样100μl。

1.2.3.2标准曲线制作配制不同浓度的ITF标准溶液，浓度梯度为(μg/ml)0、6.25、12.5、25、50、100，峰面积与浓度呈良好的线性关系r=0.998。

1.2.3.3样品制备取大鼠各段肠粘膜约200～300 mg，加2 ml生理盐水(含400 u抑肽酶)，冰浴匀浆，15000 r/min 4 ℃离心20 min，取上清100 μl进样检测。采用考马氏亮蓝G-250法测定蛋白。

1.3统计学处理

所有数据在华西医科大学PEMS程序包上作统计学处理，结果以±s表示，进行F检验。

2结果

2.1大鼠肠道中ITF mRNA的表达

ITF mRNA阳性染色主要定位于肠粘膜杯状细胞，但仅分布于杯状细胞的基底及其边缘，阳性染色区约占整个细胞的1/10，镜下观察阳性染色的杯状细胞呈空泡状，同时发现部分其它类型的肠上皮细胞中也有少量ITF mRNA表达，见图1、2。ITF mRNA在各段小肠及结肠中的表达基本类似。

图1鼠肠绒毛上呈ITF mRNA阳性染色的杯状细胞及上皮细胞()(原位杂交×100)

fig 1ITF mRNA positive goblet cell and epithelium in intestinal villus of rat()(ISH×100)

图2ITF mRNA阳性染色主要分布于杯状细胞基底部()(原位杂交×200)

fig 2ITF mRNA positive staining distributed mainly in the base of the goblet cells()(ISH×200)

2.2大鼠小肠中ITF免疫组化染色ITF阳性染色区域同ITFmRNA的表达部位一致，主要定位于杯状细胞，镜下可见许多染色深浅不一的杯状细胞，绒毛上部的杯状细胞染色较深，下端的则染色较浅，同ITF mRNA阳性染色不同的是ITF阳性染色不论染色深浅均为整个细胞着色，见图3。各肠段中ITF阳性染色的情况基本类似，呈ITF强阳性反应的杯状细胞约占总数的20%，见图4。

图3肠绒毛上呈ITF阳性染色的杯状细胞()(S-P×200)

fig 3ITF positive goblet cell in intestinal villus ()(S-P×200)

图4肠绒毛中呈ITF阳性()及ITF阴性(▲)的杯状细胞(S-P×400)

fig 4ITF positive () and ITF negative (▲) goblet

cell in intestinal villus(S-P×400)

2.3大鼠肠粘膜中ITF的含量

实验结果显示，在整个肠道中十二指肠ITF的含量最高为(369.33±65.56)ng/g(n=6)，空、回肠次之，分别为(321.66±42.12)ng/g和(296.45±55.23)ng/g，而结肠中的含量最低为(186.46±30.26)ng/g，各段小肠均明显高于结肠(P＜0.01)，但各段小肠之间相差不显著(P＞0.05)。

3讨论

ITF是一类较新的生长因子，目前国内尚未见有关报道，为了准确反映ITF在大鼠肠道中的分布规律，我们从基因水平和蛋白质水平两个层面入手，分析了ITF m