第四军医大学学报2000年第21卷第4期

宋祖军孙脊峰鲁建国谢安

摘要:目的研究Li⁺对非洲爪蟾卵母细胞表达的双基因内向整流钾通道(IRK1 - T)的作用及其机制.方法采用双微电极电压钳(TEV)法.结果 细胞外K⁺浓 度为10 mmol·L^-1时，细胞外Li⁺可加速IRK1-T内向电流的失活过程；3个指数拟 合的分析结果表明:由于细胞外Li⁺对失活过程的时间常数几乎无影响，因此Li⁺对失活过程的作用是通过Li⁺与K⁺在IRK1-T上相互竞争同一结合位点而造成的. 细胞外Li⁺对IRK1-T的瞬间内向电流(施加电压后1 ms)具有时间依赖性和电压依赖性的易化作用，增加细胞外K⁺浓度与Li⁺浓度的比率，这一易化作用增强，表明Li⁺加速IRK1-T内向电流的失活过程的作用因Li⁺浓度相对下降而减少. 细胞外Li⁺对外向电流几乎无作用；Li⁺对IRK1-T的门控特性几乎无影响；因为在细胞外加入Li⁺后反转电位几乎不变，所以IRK1-T对Li⁺不通透.结论Li⁺ 不仅是一快速通道阻断剂，而且细胞外Li⁺还可以在增大IRK1-T的内向整流作用的同时缩短该电流的时程.

关键词:Li⁺； 内向整流钾通道； 电压钳； 爪蟾卵母细胞

0引言

Li⁺是一价碱金属中最小的金属离子，研究Li⁺对双基因内向整流钾通道（IRK1-T）的作用不仅对于研究一价阳离子对IRK1-T作用的分子机制有重要作用，而且对于了解IRK1-T的通道结构和功能也有很大帮助. 以往的研究由于技术上的限制，对通道瞬间电流的分析不够精确(施加电压后10 ms)^［1］，而且采用的数据分析方法也不够精确^［2］，所以对Li⁺的作用很难做全面和准确的分析. 我们使用高质量的电流曲线和准确的分析方法对Li⁺的作用做了详细的评价，准确地发现Li⁺不仅可以加快IRK1-T内向电流的失活过程，而且 Li⁺对IRK1-T的瞬间内向电流(施加电压后1 ms)具有电压依赖性的易化作用.

1材料和方法

1.1材料我们使用的IRK的cDNA是Jan博士(加利福尼亚大学)赠与的. MRN A的线性化由XhoI酶完成，转录过程使用mCAP^TM mRNA capping试剂盒(Stratagene Inc)，由T3多聚酶转录. mRNA的检测用凝胶电泳；其浓度测量用光谱仪，并于-80℃贮存. 使用第Ⅴ和Ⅵ期的非州爪蟾卵母细胞；在无钙的Barth液中使用胶原酶I(Sigma，10 g·L^-1) 处理1.5 h, 温度20℃, 用钠升注射器(Drummond Scientific)将mRNA（质量浓度：1.85 g·L^-1，每个细胞内注入100 ng）；在正常带有抗菌素的Barth液中孵育24 h后使用.

1.2方法全细胞电流记录使用双微电极电压钳(TEV)法，放大 器 为CA-1(Dagan Corp). 用两个有3 mol·L^-1 KCl的微电极刺入细胞中，一个(尖端电 阻0.2～0.3 MΩ)做为电流电极，另一个(尖端电阻约0.5 MΩ)做为电压电极，两个电极尖端的形态特别 重要，并且于电极尖端镀上Sylgard. 感受电压的电极置于细胞1 mm左右的距离. 为了测量串联电阻，一个微电极置于细胞上前方约5 μm处，串联电阻一般小于0.2 kΩ，在需要的时候使用串联电阻补偿. 使用一接地的金属板置于微电极之间以减少电 容耦合干扰. 另一个电流电极用于进行电容补偿，旋转3个时间常数和3个相位延迟可以很好地进行电容补偿. 漏电流和电流漂移在分析数据时再除去. 对照浴液中含有(mmol·L^-1):10 KCl，80NMDG(或30 KCl加60NMDG),5HEPES,3 mg和0.2 niflumic酸(用于阻断内源性Cl电流)，pH 7.4. 研究的Li⁺作用时，使用氯化盐将NMDG置换使游离的Li⁺浓度加至80或60 mmol·L^-1,pH调为7.4. 换浴液时连续灌流速率约2.5～3 mL·min^-1. 电压 波形由586计算机与Digi Data 1200 (Axon Instruments)产生. 电流滤波频率为2 kHz，采样频率为10 kHz，Data的获取由pCLAMP6(Axon)完成. 实验时室内温度为23℃～25℃. 数据分析采用pCLAMP6, Excel 97与Origin完成.

对Li⁺阻断动力学分析是采用3个指数函数的拟合

I=A₁e^-(t-k)/τ₁+A₂e^-(t-k)/τ₂+ A₃e^-(t-k)/τ₃

其中τ为时间常数，最长的τ为阻断的时间常数，A为指数函数的权，K为进行拟合的起始时间.

数据由X±s表示，每组数据例数为3例.

2结果

2.1 Li⁺对IRK1-T的失活过程的作用及其机制细胞外K⁺浓度为10 mmol·L^-1时，细胞外Li⁺可加速IRK1-T内向电流的失活过程(Fig 1)，3个指数拟合的分析结果表明：由于细胞外Li⁺对失活过程的时间常数几乎无影响(Fig 2,B)，只是电压依赖性减小了指数拟合的权(Fig 2,A)，因此Li⁺对是通过Li⁺与K⁺在IRK1-T上相互竞争同一结合位点而造成内向电流的失活过程.

图 1Li⁺对IRK1-T的失活过程的作用

Fig 1Effects of extracellular Li⁺ on inward rectifier potassium chan nel (IRK1-T) inactivation

A: Macroscopic currents without extracellular Li⁺. B: IRK1-T current s with 80 mmol·L^-1 Li⁺. Voltage duration is:110 ms amplitude is from + 40 mV to -180 mV step -20 mV. Holding potential is -30 mV.

图 2Li⁺对IRK1-T的失活过程的作用机制

Fig 2K⁺ mechanism of effects of extracellular Li⁺ on IRK1-T inactivat ion

A: The weights of exponential fitting for inactivation. NMDG:N-methyl-D-gluca mine,Li:Lithium. B: The time constants of exponential fitting for inactivation.

2.2细胞外Li⁺对IRK1-T的瞬间内向电流具有易化作用细胞外Li⁺对IRK1-T的瞬间内向电流(施加电压后1 ms)具有时间依赖 性和电压依赖性的易化作用(Fig 3)， 细胞外K⁺浓度为10 mmol·L^-1及Li⁺浓度 为80 mmol·L^-1时，在-140 mV时瞬间内向电流增加(1.1±0.4)%,增加细胞外K⁺浓度 与Li⁺浓度的比率，这一易化作用增强,即细胞外K⁺浓度为30 mmol·L^-1及Li⁺浓 度为60 mmol·L^-1时，在-140 mV时瞬间内向电流增加(13.3±0.5)%. 细胞外Li⁺对外向 电流几乎无作用；因为规一化的电导几乎不受Li⁺的影响, 所以Li⁺对IRK1-T的门控特性几乎无影响(Fig 4)；因为在细胞外加入Li⁺后反转电位变化仅为(-0.02±0.05)mV，所以IRK1-T对Li⁺不通透. 可见Li⁺不只是一快速的开通道阻断剂.

图 3IRK1-T瞬间I-V曲线（电压加上1ms时)

Fig 3IRK1-T instantaneous I-V curve ( 1 ms after voltage applied )

Data are from Fig 1. Voltage stimulus is the same as Fig 1.［K⁺］₀ 10 mmol·L^-1+NMDG,［K⁺］₀ 10 mmol·L^-1+Li, ［K⁺］₀ 30 mmol·L^-1+NMDG，· ［K⁺］₀ 30 mmol·L^-1+Li. NMDG :N-methyl-D-glucamine,Li:lithium.

图 4IRK1-T规一化的电导

Fig 4Normalized IRK1-T conductance

Data are from Fig1.Voltage stimulus is the same as

Fig 1. symbols are same mith Fig 3.

3讨论

内向整流钾通道(IRK1，Kir2.1或I_K1)广泛存在于骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞、胶质细胞、血细胞和内皮细胞等,可维持细胞的静息电位和控制细胞的兴奋性,例如IRK1参与了心肌复极化,还可延长心室肌细胞动作电位时程，对心律失常的产生和防治有很大影响. 对IRK1的各个基<