第四军医大学学报2000年第21卷第4期

董明清朱妙章于军冯华松施溥涛

摘要: 目的比较心房钠尿肽（ANP）、血管钠肽（VNP）及C-型钠尿肽（CNP）抑制 心肌细胞增殖的效应.方法体外培养SD乳鼠心肌细胞，用蛋白激酶C激动剂佛波酯（PMA）刺激心肌细胞增殖，以总蛋白含量和噻唑蓝（MTT）比色吸光度值为指标，观察3种钠尿肽抑制心肌细胞增殖的效应.结果PMA（10^-9～10^-7mol·L^-1）致使心肌细胞的总蛋白含量和MTT吸光度值显著升高（P＜0.05）， aNP ( 10 ^-8～10^-6 mol·L^-1),VNP和CNP(10^-7～10^-6 mol·L^{- 1})均可显著降低PMA(10^-8 mol·L^-1)刺激的心肌细胞总蛋白含量和MTT吸光 度值（P＜0.05）.结论PMA对心肌细胞有促增殖作用，ANP,VNP和CNP均可抑制PMA刺激的心肌细胞增殖，抑制效应以ANP最强.

关键词:心肌细胞；心房钠尿肽；C-型钠尿肽；血管钠肽

0引言

钠尿肽家族由具有利钠、利尿和舒血管效应的一组多肽组成，是维持体内水、电解质平 衡和血压稳定的重要体液因子，它主要包括心房钠尿肽（ANP）、C-型钠尿肽（CNP）、脑钠 尿肽（BNP）及人工合成的血管钠肽（VNP）.早期对这些肽类生理作用的研究集中在其利钠、利尿和舒血管等方面. 近年来发现，ANP,CNP尚可抑制心肌、平滑肌等多种细胞增殖^［1-6］，但VNP能否抑制细胞增殖,与ANP,CNP相比作用有何差别，目前尚未见报道.我们用体外培养的心肌细胞，观察了ANP,VNP及CNP对蛋白激酶C激动剂佛波酯（PMA）刺激的心肌细胞增殖的影响.

1材料和方法

1.1材料SD乳鼠，1～3 d龄，由本校实验动物中心提供. 胰酶、MEM培养基为Gibco公司产品；胎牛血清购自浙江金华清湖犊牛利用研 究所；ANP和CNP均为人源性，VNP根据人源性ANP和CNP设计合成，分别为27,22和27肽，购自中国科学院上海生物化学研究所； PMA购自Sigma公司；考马斯亮蓝G-250,噻唑蓝（MTT）购自华美生物工程公司；紫外分光光度计、酶联免疫检测仪为Beckman公司产品. ANP,VNP和CNP：生理盐水配成100 mmol·L^-1母液，4℃保存备用（以下除另外说明外保存条件同此），用前培养液稀释; PMA:用二甲亚砜(DMSO) 配成1 mmol·L^-1母液,用前培养液稀释; mEM培养液：按说明书配制，用0.1 mol· L^-1的盐酸调pH值至7.2～7.4,用前按要求加入灭活胎牛血清;胰蛋白酶：生理盐水配制成1.25 g·L ^-1的溶液; mTT溶液:生理盐水配制成5 g·L^-1，2 wk内使用.以上溶液均经0 .22 μm滤膜过滤除菌; 考马斯亮蓝G-250染液：考马斯亮蓝G-250100 mg溶解于950 mL· L^-1的乙醇50 mL，加850 mL·L^-1的磷酸100 mL,蒸馏水定容至1000 mL; 细 胞裂解液：为双蒸水配制的0.3 mol·L^-1 naOH溶液.

1.2方法无菌条件下取出乳鼠心脏，剪碎, 1.25 g·L ^-1胰酶消化成单细胞悬液，离心（1000 r·min^-1,5 min），用含200 mL·L -1胎牛血清的MEM培养基重悬细胞，37℃,50 mL·L^-1 CO₂常氧条件孵育90 min，收集未贴壁细胞用于实验.

1.2.1MTT比色实验将细胞以5×10⁴个/孔接种于96孔培养板，100μL/孔 ，3 7℃,50 mL·L^-1 CO₂常氧条件下培养48 h，无血清MEM培养液继续培养24 h，换液 并根据实验分组加入不同试剂（ANP,VNP及CNP在加PMA之前1 h加入），继续培养24 h后每孔加入MTT溶液10μL，继续孵育4 h，吸 弃孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，测吸光度A_{490 nm}值.

1.2.2总蛋白含量测定将细胞以5×10⁵个/孔接种于24孔培养板，培养48 h，无血清MEM培养液继续培养24 h，换液并根据实验分组加入不同试剂（ANP,VNP及CNP在加PMA之前1 h加入），继续培养24 h，吸弃培养液，生理盐水洗细胞2次，每孔加细胞裂解液1 mL，100℃加热10 min裂解细胞. 每孔取100 μL与900 μL考马斯亮蓝染液混匀，放置 10 min，测吸光度A_{595 nm}值，以溶剂为空白调零，牛血清白蛋白为标准品作标准曲线，换算成总蛋白含量（mg·L^-1）.

1.2.3统计分析所有数据均以(X±s)表示，进行方差分析.

2结果

2.1 PMA对心肌细胞增殖的影响10^-9～ 10^-7 mol·L^-1的PMA可使心肌细胞总蛋白含量及MTT比色吸光度值均显著增加（Fig 1,2），相应浓度的DMSO无此作用.表明PMA可以刺激心肌细 胞的增殖并有剂量依赖性,且此效应与DMSO无关.

图 1PMA对心肌细胞总蛋白含量的影响

fig 1Effect of phorbol 12-myristate 13-acetate on total protein content i n cardiac myocytes ( n=10, X±s)

^aP＜0.05,^bP＜0.01 vs control and 10^-10 mol·L^-1.

图 2PMA对心肌细胞MTT吸光度值的影响

fig 2Effect of phorbol 12-myristate 13-acetate on A490nm value of MTT in ca rdiac myocytes ( n=10, X±s)

^aP＜0.05,^bP＜0.01 vs control and 10^-10 mol·L^-1.

图 33种钠尿肽对PMA刺激的心肌细胞总蛋白含量的影响

fig 3Effect of three natriuretic peptides on total protein content in cardiac myocytes induced by phorbol 12-myristate 13-acetate ( n=10,X±s,10^-8 mol·L^-1)

^aP＜0.05，^bP＜0.01 vs control.

2.2ANP,CNP,VNP对PMA刺激的心肌细胞增殖的影响ANP(10^-8～10^-6mol·L^-1),VNP和CNP(10^-7～10^-6mol· l^-1)均可显著降低（P＜0.05）PMA(10^-8mol·L^-1)刺激的心肌细胞 总蛋 白含量和MTT比色吸光度值, 作用强度ANP＞VNP＞CNP(见Fig3,4)，说明3种钠尿肽均可抑制PM A刺激的心肌细胞增殖，并有剂量依赖效应，抑制效应以ANP最强.

图 43种钠尿肽对PMA刺激的心肌细胞 mTT吸光度值的影响

fig 4Effects of three natriuretic peptides on A490nm value of MTT in cardiac myocytes induced by phorbol 12-myristate 13-acetates ( n=10,X±s,10^-8 mol·L^-1)

^aP＜0.05，^bP＜0.01 vs control.

3讨论

钠尿肽家族是调节水、电解质平衡、维持血压稳定的重要体液因素，具有利钠、利尿、舒血 管和抗细胞增殖等多种效应. VNP是人工合成的钠尿肽家族的新成员，是由ANP羧基末端5个氨基酸残基和CNP组合而成，结构上与ANP,CNP有很高的同源性，Wei等^［7］和冯华松等^［8］发 现，VNP有与ANP和CNP类似的利钠、利尿和舒血管作用，且舒血管作用强于ANP和CNP.本研 究中我们采用PMA刺激心肌细胞的增殖，并在此基础上观察3种钠尿肽的抗增殖效应，结果表明，PMA可以提高心肌细胞总蛋白含量及MTT比色吸光度值，即可以刺激心肌细胞增殖，AN p,VNP和CNP均可以抑制PMA刺激的心肌细胞的增殖，VNP的抑制效应弱于ANP而强于CNP.由于 PMA是蛋白激酶C（PKC）的强激动剂，而PKC激活是有丝分裂信号之一，可以刺激多种细胞的增殖^［9］，许多促增殖因素都可通过激活PKC而促进细胞增殖，提示VNP可能对抗多种促增殖 因素的促细胞增殖作用，但VNP和其他促增殖因子、其他细胞增殖之间的关系还有待于进一步研究. VNP的结合受体和受体后信号转导途径目前尚不清楚.钠尿肽结合受体有3种：A受体、B受 体和C受体.前两种是鸟苷酸环化酶偶联受体,激活后可以导致细胞内cGMP水平升高，C受体则不与鸟苷酸环化酶偶联，主要介导钠尿肽的清除（近来认为它尚有其他重要作用）. aNP ,CNP与上述3种受体均可结合，发挥生理作用，由于VNP与ANP,CNP结构的高度同源性，可能与ANP,CNP具有相同的受体途径，但这尚需进一步研究.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770317)

作者简介：董明清(1970-)，男(汉族)，山西省