中国药理学通报2000年第16卷第2期

陈江斌黄从新唐其柱李建军许家俐王晋明李庚山

摘要目的研究山莨菪碱（Ani）对家兔心室肌细胞L-型钙通道的电生理作用。方法采用全细胞膜片钳（Whole cell patch clamp）技术, 当维持电位为－40 mV，刺激频率为0.5 Hz，钳制时间为250 ms，步进电压为10 mV，去极到60 mV，观察不同浓度的Ani对L-型钙通道电流（L-I_Ca）的影响。结果0.1 mmol^．L^-1 Ani对L-I_Ca无影响（P＞0.05）；0.2、0.4和0.8 mmol^．L^-1 Ani对L-I_Ca的抑制为36.3%, 51.1%和72.8%(P均＜0.01)，且浓度愈大,其抑制作用愈强，但都不使I-U曲线的峰值发生偏移。结论Ani能浓度依赖性阻滞L-I_Ca，具有钙拮抗作用。

关键词：山莨菪碱L-型钙通道电流膜片钳心肌细胞

山莨菪碱（anisodamine, Ani）是从茄科植物唐古特山莨菪根中提取的生物碱，具有抗休克，解痉止疼等作用，已被临床广泛应用，动物实验证实它尚有显著缩小心肌梗塞范围，保护心肌功能、抗血栓形成的作用^［1,2］, 对豚鼠乳头肌电生理和机械效应的影响提示其有钙拮抗作用^［3］，并推测其具有抗心律失常作用。本研究首次采用全细胞膜片钳（Whole cell patch clamp）技术观察Ani对离体家兔单个心室肌细胞L-型钙通道电流（L-I_Ca）的影响，探讨其作用机制。

1材料与方法

1.1家兔单个心室肌细胞分离选用健康家兔，体重1.5～2.5 kg，猛击头部致昏, 迅速取下心脏, 悬挂于改良的Langendorff灌流装置上,先用正常台氏液灌流5 min后，换用低Ca²⁺(20 μmol·L^-1)台氏液灌流5 min, 再换用低Ca²⁺含0.2 g·L^-1胶原酶(I型, Sigma)的台氏液灌流5 min, 然后将Ca²⁺浓度升至70 μmol·L^-1,继续灌流5 min，此时可见心脏比原来膨胀20%～30%左右，呈樱桃色。取下心脏，沿房室沟剪下心室肌置于硅化的小三角瓶内，剪碎心室肌，在含0.1 g·L^-1蛋白酶(Sigma)的KB液中缓慢吹打孵化10 min, 最后将过滤离心后所得的心肌细胞保存在KB液中备用^［4］。选择表面光洁，横纹清楚的细胞作为实验对象。

1.2膜片钳全细胞记录方式^［4,5］微电极采用微电极拉制器(PP-83,日本光电)双步拉制而成,将尖端抛光使其光滑, 微电极充有电极内液时阻抗1～3 kΩ，使电极尖端与细胞膜表面能形成5 GΩ的封接，给电极内加一负压吸破细胞膜形成全细胞记录。对负压吸附细胞膜所产生的电容电流予以补偿，最终形成稳定电流线。

1.3实验记录方法Ani的作用机制一般认为与阻滞M-胆碱受体和α-受体有关, 现已在临床广泛应用。本实验用Cs⁺抑制时间不依赖性的内向整流K⁺电流（I_K1），以消除其对L-I_Ca的影响^［6］。当Eh大于－40 mV时，能使钠通道电流和T型钙通道电流完全失活，排除了他们对L-型钙离子电流的干扰，再将Ec去极钳到某一电位，能记录到L-I_Ca 。脉冲发放由Pclamp软件(美国Axon Inc,7.70版)经Compaq 586 计算机控制, 数字脉冲经数/模(D/A)转换器转换成模拟电压或电流信号, 经负反馈放大器(Pclamp/whole cell patch clamp amplifier CEZ-2300, 日本光电), 通过Ag-AgCl电极导入细胞产生的电流经放大, 模/数(A/D)转换后由Pclamp软件处理。

1.4溶液与药品正常台氏液成分（mmol·L^-1）：NaCl 140，KCl 5.6, CaCl₂ 1.8, NaH₂PO₄ 0.25, HEPES 5, Glucose 10, 用KOH将pH调至7.3; 低Ca²⁺台氏液成分除CaCl₂浓度为70 μmol·L^-1外, 其余成分与正常台氏液成分相同。KB液成分（mmol·L^-1）：KOH 70, KCl 40, KH₂PO₄ 20, L-glutamic acid 50, taurine 20, EGTA 0.5, HEPES 10, glucose 10, 用KOH将pH调至7.4; 电极内外液组成记录L-I_Ca的电极内液成分（mmol·L^-1）：CsCl 80，ATPNa₂ 5，MgCl₂ 2，EGTA 10，HEPES 10，用HCl将pH调至7.4。电极外液成分（mmol·L^-1）：choline cholride 120，CsOH 4，CaCl₂ 1.8，MgCl₂ 2，HEPES 10，glucose 10，用KOH将pH调至7.4。其中EGTA，HEPES，L-glutamic acid，taurine，CsCl，choline cholride，CsOH均为Sigma产品，余试剂为国产分析纯，Ani，由杭州民生制药厂生产。

1.5数据处理采用同一细胞用药自身前后对照，计量资料数据用X±s表示，采用t检验处理。

2实验步骤与结果

细胞外液灌流5 min，灌流量4 ml·min^-1，建立全细胞膜片钳记录，将维持电位(Holding potential, Eh)置于-40 mV, 步进电压为10 mV, 钳制时间为250 ms，控制电位(Command potential, Ec)从-30 mV至60 mV, 刺激频率为0.5 Hz, 测取对照值。观察不同浓度Ani对L-I_Ca的影响：用累积给药法，Ani各浓度灌流液灌流皆为5 min, 当Eh为-40 mV, Ec为10 mV时, L-I_Ca的峰值达最大, Ani浓度为0.1 mmol·L^-1时，对L-I_Ca无明显影响（n=15，P＞0.05），当用0.2、0.4和0.8 mmol·L^-1 Ani灌流后，L-I_Ca峰值由（1123.5±107.2）pA分别降至（760.77±96.9）pA、（549.35±101.39）pA和（418.52±91.39）pA，抑制率分别为36.3%（n=13, P＜0.01）、51.1%(n=9,P＜0.01)和72.8%(n=7,P＜0.01),将Ani灌流前及0.2、0.4和0.8 mmol·L^-1浓度灌流后的数据行方差分析，P＜0.01。在不同的钳制电压下，不同浓度Ani灌流对L-I_Ca抑制的电流-电压（I-U）关系曲线见图1，从图可知，L-I_Ca的峰值电流在Ec为10 mV时最大, Ani不使I-U曲线峰值发生偏移。

Fig 1Effects of Anisodamine on L-type calcium channels

of rabbit ventricular myocardium

◆—◆：0 mol·L^-1；■—■：0.1 mol·L^-1；

▲—▲：0.2 mol·L^-1；×—×：0.4 mol·L^-1；

●—●：0.8 mol·L^-1

3讨论

本研究用膜片钳技术直接测定Ani对单个心肌细胞膜L-型钙离子电流的影响，因非长时间连续进行刺激, 避免了“Run down" 现象的发生^［7］。当Ani浓度为0.1 mmol·L^-1时，其对L-I_Ca的影响不明显，当Ani浓度为0.2 mmol·L^-1时，其对L-I_Ca有抑制作用，且浓度愈大，其抑制作用亦愈大，说明Ani对L-I_Ca 的作用有剂量依赖性。此结果给Ani有负性肌力和负性频率作用，缩短慢反应动作电位时程，并降低其幅度和0期除极最大速率的结果^［3］以强有力的支持，进一步说明Ani具有钙拮抗作用。不同浓度的Ani均不使L-I_Ca的I-U曲线峰值发生偏移，其形态亦不发生明显改变，也不改变L-I_Ca的阈电位和反转电位，说明Ani对钙通道的每一个膜电位在其不同浓度时均发生成比例的、同样数量的阻滞^［8］。根据受体调节学说(Modulated receptor)推测Ani对静息态的慢钙通道(或与慢钙通道相邻的受体蛋白)的亲和力较低，而与激活态和/或失活态的慢钙通道亲和力则较高。随着Ani浓度的增加，慢钙通道内可与作用位点接近的Ani量增多，失活态慢钙通道相对增多，Ani结合慢钙通道的几率增加，故对通过慢钙通道离子流的抑制增大^［9,10］。Ani是否尚作用于受体依赖性钙通道，有待于进一步研究。

作者简介：陈江斌，男，32岁，硕士；

黄从新，男，48岁，教授，博士生导师

陈江斌（湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉430060）

黄从新（湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉430060）

唐其柱（湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉430060）

李建军（湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉430060）

许家俐（湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉430060）

王晋明（湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉430060）

李庚山（湖北医科大学附属第一医院心血管病研究室，武汉430060）

参考文献

1．姚秀娟，谭月华，许自超. 山莨菪碱对心肌缺血再灌注损伤的作用与脂质过氧化.中国药理学报，1995;16(2):152～4

2．杨苹，张宝恒，洪霓. 山莨菪碱抗心律失常及对植物神经系统的影响. 中国药理学报， 1991;12(2):173～6