中国药理学通报200年第16卷第2期

金春华刘杰黄绪亮赵克森

摘要目的观察虎杖苷对大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC) 内游离钙浓度的变化，以探讨虎杖苷对血管平滑肌细胞的调节机制。方法用荧光染料Fluo-3-AM标记细胞，在粘附式细胞仪上 测定细胞内游离钙的变化。结果给予虎杖苷5 min后，VSMC内游离钙浓度升高。当虎杖苷加入前10 min 用河豚毒素和优降糖分别预处理后，其VSMC内游离钙都不再明显升高; 而给予普萘洛尔、甲氰咪胍及亚甲蓝分别预处理时，细胞内钙浓度反而升得更高, 与单纯虎杖苷作用相比差异都有显著性。结论虎杖苷可增加细胞内游离钙浓度，其作用可能与钠、钾通道开放有关，并且受β肾上腺素能受体、H₂受体系统及鸟苷酸环化酶系统的反向调节。

关键词：血管平滑肌钙大鼠受体鸟苷酸环化酶

虎杖苷(polydatin, PD)是从中药虎杖中提纯的一种单体，它具有调节血管口径、改善微循环灌流等功效^［1～3］，并且发现它具有促进细胞外钙离子进入平滑肌细胞的作用^［4］。但对于虎杖苷对血管平滑肌细胞内钙信号的调节机制尚不是很清楚。本文用粘附式细胞仪(ACAS 570) 观察了不同药物预处理后，虎杖苷对血管平滑肌细胞(VSMC)内钙离子浓度（［Ca²⁺］_i）影响，以探讨其对血管平滑肌细胞调节的分子机制。

1材料

Sprague-Dawley大鼠，160～200 g, ♀♂不限。虎杖苷由我校化学教研室提纯制备(纯度＞98%)，用D-Hanks液配成2 mmol·L^-1浓度(实验中PD终浓度为0.6 mmol·L^-1)。荧光探针Fluo-3-AM (美国Molecular Probe公司), 超级小牛血清(杭州四季青公司)，粘附式细胞仪(570型，美国Meridian公司)，河豚毒素(TTX, Sigma), 其它为国产试剂。 TTX、优降糖(glybenclamide)、利及丁(regitine)、甲氰咪胍(cimetidine)和亚甲蓝(methylene blue)均用D-Hanks液分别配制成1 μmol·L^-1、1 μmol·L^-1、0.8 mmol·L^-1、1 mmol·L^-1和0.8 mmol·L^-1。

2方法

2.1大鼠血管平滑肌细胞分离大鼠麻醉后断头处死，无菌取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜组织和内皮，然后将血管切成约1 mm²大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基，倒置3～5 h后翻转，于37℃ 0.05 CO₂的细胞培养箱中静置3 d，然后每2 d换液。一般5 d左右平滑肌细胞从组织块中爬出，待细胞快融合时用2.5 g·L^-1胰蛋白酶消化传代，取3～8代细胞做实验。细胞经电镜及α-actin免疫组化鉴定为平滑肌细胞。

2.2荧光染料配制取Ca²⁺敏感荧光染料 Fluo-3-AM 50 μg 用纯二甲亚砜(DMSO) 45 μl溶解, 配成1 mmol·L^-1储存溶液，-20℃避光保存。临用前用含20 mmol·L^-1 HEPES 的无血清DMEM缓冲液将其稀释成10 μmol·L^-1。

2.3血管平滑肌细胞的荧光染色测定实验前2 d，将培养的VSMC传代至ACAS 570测定所需的特制小皿上，测定前用无血清DMEM 缓冲液洗涤小皿2～3遍, 加入荧光染料2滴, 37℃避光温育30～60 min, 再用缓冲液洗3遍, 即可上机测定。

2.4VSMC内游离钙的测定^［5］利用特异荧光染料, ACAS 570可敏感检测可贴壁粘附的活细胞内游离钙(［Ca²⁺］_i)的动态变化。荧光探针Fluo-3-AM进入细胞，在细胞内水解脱去AM基团后与细胞内游离钙结合，在488 nm波长蓝色激光激发下产生荧光。Fluo-3 产生的荧光强度与细胞内游离钙浓度成正比。

2.5实验设计实验中设对照组(给予D-Hanks液)、单纯虎杖苷组、阻断剂处理组(加TTX、亚甲蓝等不同阻断剂预先孵育10 min再加PD处理), 分别测定加入PD后5 min内VSMC内钙离子浓度的动态变化。

2.6数据处理数据经ACAS 570微机系统对图形及时间进行实时测量而获得，以未加虎杖苷处理前的荧光值为100%，以X±s表示，数据以students t 检验进行显著性检验。

3结果

3.1虎杖苷对VSMC内游离钙浓度的影响(n=8)给予虎杖苷(0.6 mmol·L^-1)后，细胞内游离钙浓度持续升高，在5 min时钙浓度比初始值高16%±1.3% ,与对照组(n=6)差异有显著性(t=13.415, P＜0.01，见图1)。

Fig 1The effects of polydatin on ［Ca²⁺］_i of VSMC

VSMC were treated with PD (0.6 mmol·L^-1,n=8) or D-Hanks solution (control,n=6); ■—■：control;△—△：PD；^·P＜0.05 vs control

3.2虎杖苷作用与α、β肾上腺素能受体及H₂受体系统的关系当给予β肾上腺素能受体阻断剂利及丁(0.8 mmol·L^-1) 预处理后，再给虎杖苷5 min后细胞内游离钙浓度升高到初始值的118%±4.2% (n=6, 与单纯虎杖苷作用相比，t=0.922, P＞0.05); 给予α肾上腺素能受体阻断剂普萘洛尔(3 mmol·L^-1) 预处理后，细胞内钙浓度在虎杖苷作用后5 min显著升高到初始值的130%±6.7%(n=5，与单纯虎杖苷作用相比，t=4.063, P＜0.01); 而H₂受体阻断剂甲氰咪胍则与虎杖苷产生强烈的协同作用，使细胞内游离钙浓度5 min后上升到初始值的149.2%±5.2%(n=5，与单纯虎杖苷作用相比, t=12.306, P＜0.01，见图2）。

3.3虎杖苷作用与细胞膜上钠、钾通道的关系给予钠通道阻断剂河豚毒素(1 μmol·L^-1)预处理后再给虎杖苷时，细胞内游离钙浓度无明显升高，仅为初始值的103.5%±4.36%(n=8); 而钾通道阻断剂优降糖(1 μmol·L^-1)预处理后，虎杖苷的升钙作用也不明显，仅为初始值的107%±5.66% (n=6)，与单纯虎杖苷作用相比差异有显著性。（河豚毒素组t=5.495, P＜0.01; 优降糖组t=3.169, P＜0.05，见图3）。

Fig 2The influence of pretreatment of α,β,H₂-receptor

antagonists on ［Ca²⁺］_i of VSMC

Cells were pretreated with negitine (0.8 mmol·L^-1, n=6),propranolol (3 mmol·L^-1,n=5) and cimetidine (1 mmol·L^-1,n=5), respectively, then PD (0.6 mmol·L^-1) was added; ◆—◆：PD；■—■：regitine；▲—▲：propranolol；—:cimetidine；^..P＜0.01 vs PD group

Fig 3The effects of Na⁺,K⁺ channel blockers on ［Ca²⁺］_i of VSMC

Cells were pretreated with TTX (1 μmol·L^-1) and Gly( 1 μmol·L^-1), PD (0.6 mmol·L^-1) was added 10 min later; ◆—◆：TTX；■—■：Gly；△—△：PD；^·P＜0.05，^..P＜0.01 vs PD group

3.4虎杖苷作用与cGMP系统的关系当给予鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝预处理后，再加虎杖苷时，细胞内钙浓度明显升高，5 min后达初始值的157%±16.7% (n=5)。比单纯虎杖苷作用更显著(t=4.831, P＜0.01，见图4）。

4讨论

细胞内游离钙作为细胞内的一种第二信使调节着细胞的多种生理功能，包括细胞兴奋、肌肉和血管的收缩与舒张等^［6］。细胞内游离钙浓度升高来源于细胞外钙离子经肌膜上钙通道进入，和/或由细胞内肌浆网中储存钙的释放引起。而细胞内游离钙浓度降低则可能主要是被肌浆网重新摄取所致^［7，8］。机体的神经系统以及激素、细胞因子等细胞受体激动剂或拮抗剂以及细胞膜离子通道或细胞内激酶活性的改变都可影响细胞内游离钙的含量，从而调节细胞功能。

Fig 4The pretreatment of cGMP cyclase

inhibitor on the ［Ca²⁺］_i of VSMC

cells were pretreated with methylene blue (0.8 mmol·L^-1,n=5)10 min before PD(0.6 mmol·L^-1) adding;◆—◆：PD；■—■：methylene blue；^**P＜0.01 vs PD group

在本实验中，当大鼠主动脉血管平滑肌细胞给予虎杖苷后可引起细<