中国药理学通报2000年第16卷第2期

王中峰开丽肖欣荣

摘要目的研究粉防己碱(Tet)对大鼠肺动脉平滑肌细胞小电导钙激活钾通道(SK_Ca)的作用。方法内面朝外膜片箝单通道记录法。结果Tet7.5 μmol·L^-1对电导值为10 pS的SK_Ca无明显影响,15 μmol·L^-1可增加SK_Ca开放的概率，改变通道的开放和关闭模式，30μmol·L^-1降低通道的开放概率，通道开放以短暂簇状为主。结论Tet对肺动脉平滑肌SK_Ca的作用与Tet的浓度有关，合适浓度下可增加通道的开放，K⁺外流增多，与Tet降低肺动脉张力有关。

关键词：粉防己碱钾通道钙膜片箝技术平滑肌肺动脉大鼠

粉防己碱(tetrandrine, Tet)已用于临床治疗心律失常和高血压。Tet有阻断Ca²⁺通道和神经末梢钙激活钾通道，以及舒张平滑肌的作用^［1～4］。作者也发现Tet对肺动脉平滑肌大电导钙激活钾通道有双重作用^［5］，由于钾通道的激活，特别是钙激活钾通道(calcium-activated potassium channels,K_Ca)和ATP-敏感钾通道,可降低由缺氧所致的肺动脉收缩,降低肺动脉张力^［6～8］,本文用膜片箝技术研究Tet对肺动脉平滑肌小电导钙激活钾通道(small-conductance calcium-activated potassium channel, SK_Ca)的作用,以进一步阐明Tet的血管舒张作用机制。

1材料与方法

1.1药品和试剂Tet(纯度＞98%，浙江金华制药厂)，胶原酶(Ⅺ型，Sigma), 木瓜蛋白酶(Sigma), 牛血清白蛋白(Sigma), 四乙基胺(TEA, Sigma)；二硫苏糖醇(DTT, Sigma); 多聚赖氨酸(Sigma); HEPES (Sigma), N-trimethylsilydiethylamine(Sigma),其余均为国产分析纯。

1.2肺动脉平滑肌细胞分离按参考文献介绍的方法略加改进^［6，7］。成年♂ Wistar大鼠，200～250g，由第三军医大学实验动物中心提供, 10 g·L^-1戊巴比妥钠33 mg·kg^-1腹腔注射麻醉后, 开胸分离肺及心脏, 并迅速移至4℃的分离液中(mmol·L^-1:NaCl130, KCl5, MgCl₂1.2, CaCl₂1.5, HEPES 10,葡萄糖10, pH 7.3),仔细分离肺动脉干及1～3级小动脉分支, 并去除内膜, 将动脉剪碎,37℃的低钙(20 μmol·L^-1)分离液中孵育20min后, 移入1ml低钙液内, 加入胶原酶1 mg, 木瓜蛋白酶1 mg, DTT 1 mmol·L^-1, 牛血清白蛋白2mg,37℃恒温消化40 min, 1 000×g离心5 min,沉淀用2 ml无钙分离液悬浮, 用尖端火抛光的Pasteur吸管缓慢吹打使组织分散,细胞悬液滴加于事先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上,4℃保存,8 h内备用。

1.3溶液电极液(mmol·L^-1): KCl140, MgCl₂1, Na₂ATP0.5, EGTA6, CaCl₂5.4, HEPES10, KOH调pH至7.4。浴液成分同电极液。

1.4电生理记录玻璃微电极用微电极拉制器(PP-83, Narishige, Japan)两步拉制,尖端直径1～1.5 μm,涂布N-trimethylsilydiethylamine,并进行热抛光,充灌电极液后电极电阻4～6 MΩ。在室温下(23℃±2℃)用内面朝外(inside-out)膜片箝记录方式记录单通道电流, 电流经膜片箝放大器(CEZ-2200, Nihon Kohden, Japan)放大, 放大器低通滤波1 kHz,用pClamp软件(6.02版, Axon Instrument, USA)不间断录入微机, 采样频率10 kHz,3 kHz滤波。在形成内面朝外式结构后,记录通道电流,并确认通道性质, 以-200 mV箝制电位, 0.2 μmol·L^-1游离Ca²⁺下的电流记录作为对照,然后加入Tet,其终浓度分别为7.5,15和30 μmol·L^-1,再次记录同一膜片上的通道电流。

1.5结果分析和处理通道电流用高斯分布拟合,开放和关闭时间用指数拟合,开放时间除以总采样时间求出开放概率.数据用X±s表示,单因素方差分析统计学处理。

2结果

2.1肺动脉平滑肌细胞SK_Ca的电导形成内面朝外膜片箝记录结构后,胞内面朝向浴液, 其中游离Ca²⁺浓度为0.3 μmol·L^-1,在-200 mV至+200 mV不同的箝制电位下, 记录通道的单通道电流, 绘制其电流-电压曲线(见图1), 计算出通道的电导为(10.6±0.4) pS。增加胞内钙浓度, 通道开放显著增加, 说明记录到的是SK_Ca(n=7)。

Fig 1I-U relationship of small-conductance calcium-activated

potassium channels of rat pulmonary artery smooth muscle cells

2.2Tet对SK_Ca的作用将细胞膜电位箝制在-200 mV,以内面朝外方式记录通道电流, 其开放时间符合单指数分布,时间常数τ为(5.84±1.56) ms, 关闭时间符合双指数分布, 时间常数τ₁和τ₂分别为(101.8±7.5) ms和(370.8±15.6) ms,通道开放的电流幅度(2.28±0.06) pA,开放概率0.012±0.004。

当浴液中加入Tet 7.5 μmol·L^-1,通道电活动与加药前无明显变化,Tet浓度增加到15μmol·L^-1时,通道开放时间转变为双指数拟合,其时间常数τ₁和τ₂分别为(3.88±1.05) ms和(31.25±7.22) ms,开放概率显著增加到0.042±0.010 (P＜0.01), 关闭时间变为单指数拟合,时间常数τ为(205.8±12.2) ms,当Tet浓度增大到30 μmol·L^-1时，通道转变为短暂簇状(brief)开放,开放时间常数τ₁和τ₂分别减小到(0.075±0.012) ms和(0.928±0.047) ms,关闭时间常数又转变为双指数拟合,时间常数τ₁和τ₂分别为(3.33±0.45) ms和(32.41±4.37) ms,开放概率降低到0.011±0.002.在此基础上将胞内钙浓度提高到1 μmol·L^-1, 通道的开放概率又增加,但开放仍以短暂开放为主,开放的频率增加,再加入四乙基胺10 μmol·L^-1,通道电活动无明显变化(见图2, n=7)。

Fig 2Effects of tetrandrine (Tet) on small-conductance calcium-activated potassium channels in isolated rat pulmonary artery smooth muscle cells at a membrane potential -200 mV from an inside-out membrane patch exposed to symmetrical KCl 140 mmol·L^-1

A: Control; B: Tet 7.5 μmol·L^-1;

C: Tet 15 μmol·L^-1; D: Tet 30 μmol·L^-1;

E: Ca²⁺1 μmol·L^-1; F: TEA 10 μmol·L^-1

3讨论

K_Ca广泛存在于哺乳动物的可兴奋细胞膜, 依据其电生理学性质及电导水平, 一般分为小电导(10～35) pS,中电导(40～100) pS和大电导(100～300) pS^［9］.本实验用内面朝外膜片箝记录技术, 在胞内外140 mmol·L^-1对称KCl的状态下,成功地记录了大鼠肺动脉平滑肌膜SK_Ca,该通道对胞内Ca²⁺浓度变化十分敏感,电导值约10 pS,且对胞内施加钾通道阻断剂TEA不敏感,属于典型的SK_Ca^〔9〕。较低浓度的Tet对SK_Ca无显著影响,但随着Tet浓度增加，通道的开放概率增加，说明Tet在合适的浓度下有SK_Ca激活作用，增加K⁺外流, 而且可以改变通道的开放和关闭模式, Tet对肺动脉平滑肌SK_Ca的作用是Tet降低肺动脉张力的原因之一。当Tet浓度过高时, 反而降低通道的开放概率, 使通道呈短暂开放状态, 此作用可能是Tet浓度过高的毒性作用, 与Tet对肺动脉平滑肌大电导K_Ca的作用相似^〔5〕, Tet影响SK_Ca作用的机制还有待进一步研究。

作者简介：王中峰, 男, 34岁, 医学博士, 现为中国科学院上海生理研究所博士后, 从事生物活性物质与离子通道研究

王中峰（第三军医大学生理学教研室,重庆400038）

王中峰（现在中国科学院上海生理研究所,上海200031）

开丽（第三军医大学大坪医院野战外科研究所,重庆400042）

肖欣荣（华西医科大学附一院呼吸内科,成都610041）

参考文献

1．Liu QY, Karpinski E, Rao MR, Pang PKT. Tetrandrine, a novel calcium channel antagonist inhibits types Ⅰ calcium channels in neuroblastoma cells. Neuropharmacology, 1991;30(12A):1325～31

2．Wang G, Lemos JR. Tetrandrine blocks a slow, large-conductance, Ca²⁺-activated potassium channel besides inhibiting a non-inactiva