中国药理学通报2000年第16卷第2期

任亚军佟晓永王晓良

摘要目的研究ATP敏感钾通道（K_ATP）亚单位在大鼠组织中的表达。 方法逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测通道mRNA的表达。 结果左心室有Kir 6.1，Kir 6.2和SUR 2A的表达，大脑皮层中Kir 6.1，Kir 6.2，SUR 1，SUR 2B均有表达，主动脉平滑肌有Kir 6.1，Kir 6.2， SUR 2B的表达，膀胱平滑肌中有Kir 6.1，Kir 6.2，SUR 2B的表达。结论各组织的KATP组成有所不同，Kir 6.1、Kir 6.2和SUR 2B亚单位在多组织中广泛表达。

关键词：逆转录PCRATP敏感钾通道mRNA表达

自1983年Noma第1次在心肌上发现ATP敏感钾电流以来，研究表明在多种组织中均可记录到此种电流。随着分子生物学技术的迅猛发展，现认为ATP敏感钾通道（K_ATP）是由两种亚单位组成的四聚体，即由内向整流钾通道（Kir 6.X家族）和硫脲类受体（SUR）组成的四聚体。Kir 6.X 家族已发现两种: Kir 6.1 和Kir 6.2，SUR也发现两种：SUR 1和SUR 2，SUR 2又有两种不同的剪接体形式即SUR 2A和SUR 2B。K_ATP在各个组织中的表达分布是不同的。本文应用RT-PCR技术研究了这4种亚单位在大鼠多种组织中的表达差异。

1材料与方法

1．1材料健康♂Wistar大鼠由中国医科院实验动物中心提供，体重230～260 g。2400型PCR仪（美国PE公司）。Taq DNA聚合酶（华美公司）。AMV逆转录酶，随机引物（核酸六聚体），dNTP，RNasin均购自Promega公司。Trizole由博大公司提供。其它均为国产分析纯试剂。特异引物由上海Sangon公司合成，以下为各种引物的序列：①Kir 6.1 Forward: GAGTGAACTGTCGCACCAGA (1292～1311) ；Reverse: CGATCACCAGAACTCAGCAA (1539～1520，Genebank accession No D42145; 扩增长度 209 bp)。 ②Kir 6.2: Forward TCCAACAGCCCGCTCTAC (787～804)；Reverse: GATGGGGACAAAACGCTG (954～937，Genebank accession No D 50581; 扩增长度 167 bp)。③SUR 1：Forward: GGAGCAATCCAGACCAAGAT (1424～1443)； Reverse: AGCCAGCAGAATGATGACAG (1672～1653，Genebank accession No L 40624; 扩增长度 210 bp)。④SUR2A/2B： Forward: ACACGC TCCGCTC CAG GCTG (4300～4319)；Reverse: GCCAGGCAGAACAGCTGTCT (4531～4512，Genebank accession No D 86038; 相对应的扩增长度2A为407 bp，2B为231 bp)。

1．2方法

1．2．1组织总RNA的提取大鼠断头后迅速取出大脑皮层、左心室、主动脉平滑肌(去内皮细胞)和膀胱平滑肌，置于液氮中保存，用Trizole按一步法提取总RNA。所提的总RNA在A 260/A 280的比值大于1.8且EB染色后28 s和18 s两条带清晰可见呈2∶1且无基因组污染时可用。

1．2．2逆转录反应取2 μg总RNA，分别加入下列成分：dNTPs混合物（每种dNTP各10 mmol·L^-1）2.5 μl；随机引物：0.5 μg；RNasin 20 U；加无RNase水至19 μl，混匀后70℃变性5 min，迅速冰浴。最后加入AMV酶 1 μl；5×缓冲液 5 μl 使总反应体系为25 μl。上述混合物在42℃反应1 h，接着90℃变性5 min后冰浴，进行扩增反应，或在-70℃保存待用。

1．2．3扩增反应取以上逆转录产物2 μl，分别加入以下成分：dNTP（每种各2.5 mmol·L^-1） 4.0 μl；特异引物 500 pmol；10×缓冲液 5 μl；Taq 酶1 U；加蒸馏去离子水使整个反应体系为50 μl。用以下条件进行PCR反应：SUR 2A/2B扩增^［1］：起始变性94℃ 4 min，循环时94℃ 45 s，55℃ 1 min，72℃ 2 min，共进行30轮循环，最后延伸72℃ 8 min。其它扩增反应^［2］：起始变性94℃ 4 min，循环时94℃ 1 min，57℃ 30 s，72℃ 1 min，共进行32轮，最后延伸72℃ 1 min。PCR扩增产物经17 g·L^-1琼脂糖凝胶电泳辨认。

2试验结果

2.1左心室K_ATP亚单位成分的表达见图1，左心室有Kir 6.1，Kir 6.2和SUR 2B的表达。

Fig 1Expression profiles of K_ATP

channel subunits in rat left ventricle.

A:SUR 2(2A：407 bp，2B:231 bp)；B:SUR 1(248 bp);C:Kir 6.2(167 bp);D:Kir 6.1(247 bp);E:100 bp ladder

2.2大脑皮层K_ATP亚单位成分的表达见图2，大脑皮层中Kir 6.1，Kir 6.2，SUR 1，SUR 2B均有表达。

Fig 2Expression profiles of K_ATP channel

subunits in rat cerebral cortex

A:SUR 2(2A：407 bp，2B:231 bp);B:SUR 1(248 bp);C:Kir 6.2(167 bp);D:Kir 6.1(247 bp);E:100 bp ladder

2.3主动脉平滑肌K_ATP亚单位成分的表达见图3，主动脉平滑肌有Kir 6.1，Kir 6.2， SUR 2B的表达。

Fig 3Expression profiles of K_ATP

channel subunits in rat aorta

A:SUR 2(2A：407 bp，2B:231 bp);B:SUR 1(248 bp);C:Kir 6.2(167 bp);D:Kir 6.1(247 bp);E:100 bp ladder

2.4膀胱平滑肌K_ATP亚单位成分的表达见图4，膀胱平滑肌中有Kir 6.1，Kir 6.2，SUR 2B的表达。

Fig 4Expression profiles of K_ATP

channel subunits in rat urinary bladder

A:SUR 2(2A：407 bp，2B:231 bp);B:SUR 1(248 bp);C:Kir 6.2(167 bp);D:Kir 6.1(247 bp);E:100 bp ladder

3讨论

K_ATP在体内发挥着重要的作用，它参与细胞静息膜电位的维持和平滑肌肌张力的调节，是将体内代谢状态与细胞兴奋性相偶连的重要机制。K_ATP是由Kir 6.X和SUR两种亚单位组成的四聚体结构，其中Kir 6.X亚单位负责通道的K⁺穿透作用，SUR亚单位负责对通道的调节，即通道的调节单位。现普遍认为不同组织K_ATP至少有3种组成类型^［3］：SUR 1/Kir 6.2 (胰腺型)，SUR 2A/Kir 6.2 (心脏型)，SUR 2B/Kir 6.1 (血管平滑肌型)。Inagaki等^［4］报道SUR 2A是组成心脏K_ATP的成分之一，本文研究表明在大鼠左心室中有Kir 6.1, Kir 6.2和SUR 2B的表达，最近Liss等^［5］用单细胞RT-PCR技术证实在小鼠心肌细胞上同时有SUR 2A和SUR 2B的表达，我们推测在心肌不同部位可能有不同的SUR 2亚型的表达，左心室部位SUR 2A为主，因此心脏可能有不止一种K_ATP组成形式。大脑皮层是最为复杂的神经组织，它由多种类型的神经细胞组成，因此K_ATP在大脑皮层的组成及分布也极其复杂，我们的研究表明在大脑皮层中除SUR 2A外其它亚单位均有表达，这需要进一步应用PATCH和单细胞RT-PCR技术来分析每一类细胞的K_ATP组成。有报道^［6］ 在大鼠纹状体胆碱能神经细胞内只有Kir 6.1和SUR 1亚单位的表达也证实了这一点。研究证实在众多平滑肌组织中都有ATP敏感钾电流的存在，包括兔肠系膜动脉平滑肌（Nelson et al，1990）、兔门静脉平滑肌（Kitamura和Kuriyama，1994）、豚鼠膀胱平滑肌（Bonev和Nelson，1993）、豚鼠胆囊平滑肌（Zhang et al，1994）等。本文首次报道在大鼠膀胱平滑肌中有Kir 6.1、Kir 6.2和SUR 2B的表达，没有SUR 1和SUR 2A的表达，与主动脉平滑肌中亚单位的表达相同，Koh等^［2］指出在小鼠直肠平滑肌中只有Kir 6.2和SUR 2B的表达，因此推测在不同类型的平滑肌中有不同的K_ATP组成。最近Zhang等^［7］报道大鼠门静脉平滑肌上记录到两种不同电导的K_ATP电流：LK和MK，因此平滑肌细胞的K_ATP的组成也是很复杂的。

我们发现在以上组织中Kir 6.2和SUR 2都有表达，与文献报道一致^［8］，同时也观察到Kir 6.1亚单位也有广泛表达，这种广泛表达与各组织中生理活性K_ATP通道的联系还需进一步的研究。

国家自然科学基金资助课题，No 39770859

作者简介：任亚军，男，29岁，博士研究生；

王晓良，男，45岁，医学博士（德国），研究员，博士生导师，中国药理学会常务理事

任亚军（中国医学科学院·中国协和医科大学药物研究所，北京100050）

佟