中国药理学通报2000年第16卷第2期

魏文利关永源贺华孙家钧

摘要目的研究ATP触发牛主动脉内皮细胞Ca²⁺内流特性，Cl^-通道阻断剂furosemide和PKC抑制剂staurosporine对其影响，阐明Cl^-通道和PKC与ATP触发Ca²⁺内流的内在联系。方法采用Fura-2荧光测定胞浆Ca²⁺变化技术，在培养的乳牛主动脉内皮细胞上观察药物对ATP触发Ca²⁺内流的影响。结果ATP触发的Ca²⁺内流不受电压依赖性钙通道(VDC)阻断剂nifedipine影响，但可被非VDC阻断剂SK&F 96365，非选择性阻断Ca²⁺通道的金属离子NiSO₄和PKC抑制剂staurosporine抑制。furosemide (1.25～10 μmol·L^-1)呈浓度依赖性抑制ATP触发的Ca²⁺内流，10 μmol·L^-1 可抑制36%±14%。当staurosporine(100 nmol·L^-1)或SK&F 96365(15 μmol·L^-1)分别对Ca²⁺内流最大程度抑制34%±5%和64%±11%后，furosemide可分别进一步抑制7.6%±4%和14%±7%。结论furosemide敏感的Ca²⁺内流与SK&F 96365敏感的Ca²⁺内流存在非同一性。furosemide敏感的Cl^-通道开放与PKC激活均参与了ATP触发的Ca²⁺内流，这两种因素与Ca²⁺内流之间存在内在联系。

关键词：血管内皮细胞三磷酸腺苷(ATP)Ca²⁺通道Cl^-通道蛋白激酶C(PKC)

血管内皮细胞不仅是血液和组织之间的一种细胞屏障，而且能合成和释放多种血管活性物质，对维持血管的生理功能起重要作用。ATP与内皮细胞膜上P₂受体结合，使内皮细胞合成和释放血管松弛因子如一氧化氮，前列环素等，导致血管松弛，后者的释放往往与内皮细胞内游离Ca²⁺水平(［Ca²⁺］_i)持续升高有关^［1,2］。

牛主动脉内皮细胞上至少存在两种P₂受体：P_2Y和P_2U，它们均与磷脂酶C(PLC)偶联引起［Ca²⁺］_i升高^［3,4］。P₂受体激动后通过G蛋白激活PLC，水解磷脂酰肌醇生成1,4,5-三磷酸肌醇(IP₃)和二酰基甘油(DAG)，IP₃与内质网膜上IP₃受体结合，引起Ca²⁺池Ca²⁺释放，［Ca²⁺］_i迅速升高，同时Ca²⁺池耗竭可导致胞膜上Ca²⁺池操纵的Ca²⁺通道(SOC)开放，触发胞外Ca²⁺内流；DAG可激活蛋白激酶C(PKC)，调节Ca²⁺内流^［4］。胞内Ca²⁺释放虽能使［Ca²⁺］_i迅速升高至峰值，但维持时间很短，而［Ca²⁺］_i持续升高有赖于胞外Ca²⁺内流，并涉及多种Ca²⁺内流通道。由于Ca²⁺内流的机制非常复杂，因此至今仍是众多研究的焦点。

内皮细胞是非兴奋性细胞，胞膜上没有电压依赖性Ca²⁺通道(voltage-dependent calcium channel; VDC)，P₂受体激活后Ca²⁺内流主要通过非VDC途径，一般认为Ca²⁺池耗竭引起的Ca²⁺内流是其主要的Ca²⁺内流途径，但具体机制尚不清楚^［5］。

近年来Cl^-通道在受体激活触发的Ca²⁺调控中所起的作用引起人们的重视。内皮细胞存在多种类型的Cl^-通道^［6］，据报道ATP可触发一种Ca²⁺依赖性Cl^-电流，这种Cl^-电流可被Cl^-通道阻断剂DIDS，NPA等抑制^［7］。但Cl^-通道开放在ATP触发Ca²⁺内流中的作用及机制尚不清楚。

内皮细胞PKC有多种亚型，催化胞内多种蛋白质磷酸化，参与细胞诸多生理活动。在血管平滑肌细胞受体激动后PKC可直接兴奋VDC，促进Ca²⁺内流，但PKC在内皮细胞Ca²⁺调控中所起的作用还不清楚。

本文采用Fura-2荧光测定胞浆Ca²⁺变化技术，研究ATP触发牛主动脉内皮细胞Ca²⁺内流的特性，Cl^-通道阻断剂furosemide和PKC抑制剂staurosporine对其影响，探讨Cl^-通道和PKC与ATP触发Ca²⁺内流之间的内在联系。

1材料与方法

1.1实验材料Fura-2/AM, bovine serum albumin (BSA) 购于Boehringer Mannheim公司 (Germany); RPMI 1640购于Gibco BRL公司(USA); SK&F 96365 购于Biomol Resarch Labs公司（USA);ATP, furosemide, staurosporine, nifedipine, typsin, HEPES, EGTA; DMSO等购于Sigma公司(USA)。新生小牛血清由中山医科大学微生物教研室提供。其余试剂均为国产分析纯。

1.2实验仪器RF-5000荧光分光度计（日本岛津公司）；CO₂培养箱（美国Precision公司）；倒置显微镜（重庆光学仪器厂）。

1.3牛主动脉内皮细胞分离和培养新生1～2 d健康乳牛，颈动脉放血处死，无菌条件下分离主动脉，清除动脉外壁的筋膜和脂肪，用PBS(mmol·L^-1: NaCl 130, KCl 2.5,Na₂HPO₄ 10, KH₂PO₄ 1.5, pH 7.4)冲洗2次，沿正中剪开，内膜朝下贴于已经滴加少量0.1%胰蛋白酶和0.02% EDTA的培养皿中，37℃消化10 min。用细胞刮子轻轻刮取内膜上的内皮细胞，置入加有RPMI 1640培养液（含20%小牛血清，2×10⁵ U·L^-1青霉素和200 mg·L^-1链霉素）的培养瓶中，静置于CO₂培养箱(0.05 CO₂，37℃)内，2 h后换为新鲜培养液继续培养，约4～5 d细胞长满整瓶即可进行传代。细胞传代时，先用PBS洗1次，加0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化1～2 min，待细胞变圆并开始与瓶壁脱离时吸弃消化液，加入RPMI 1640培养液（含10%小牛血清，10⁵ U·L^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素）终止消化，吹匀后按1∶2接种传代。实验用第3～5代细胞。

1.4细胞［Ca²⁺］_i测定按前文方法测定^［8］，当内皮细胞生长达80%～90%融合时, 终止培养制成混悬液，用含1 μmol·L^-1 Fura-2/AM的HBSS缓冲液(μmmol·L^-1: NaCl 145, KCl 5, CaCl₂ 1.5, MgCl₂ 1, glucose 5, HEPES 10, 0.01% BSA, pH 7.4)重悬细胞，调节细胞密度为每毫升约10⁶个细胞，将细胞放入CO₂培养箱中37℃负载30 min，500 rpm离心2 min收集细胞，再用HBSS缓冲液悬浮细胞，调节细胞密度至每毫升约5×10⁵个细胞进行细胞［Ca²⁺］_i测定。若作无Ca²⁺液测定，换成无Ca²⁺的HBSS重悬细胞，并于测量前1 min在样品中加入200 μmol·L^-1 EGTA。

实验采用RF-5000荧光分光光度计，激发光波长分别为340 nm和380 nm；发射光波长为510 nm。根据公式计算细胞［Ca²⁺］_i：［Ca²⁺］_i =K_d×Sb₁/Sb₂×(R-R_min)/(R_max-R)。其中：K_d：Fura-2与Ca²⁺结合的平衡解离常数，在37℃，细胞内环境下，其数值为224 nmol·L^-1。R：实验记录到的在两种波长的激发光条件下的细胞内荧光强度比值(F340/F380); R_max: Fura-2被Ca²⁺完全饱和时的F340/F380值，通过在细胞外Ca²⁺浓度为1.5 mmol·L^-1时加入0.1% triton X-100测得。R_min: Fura-2 在完全游离时的F340/F380值，通过加入EGTA（终浓度为6 mmol·L^-1）测得；Sb₁/Sb₂：Fura-2 在完全游离以及与Ca²⁺结合达饱和状态时，于380 nm激发处的细胞荧光强度之比。测定结果由RF-5000荧光分光光度计计算并直接打印出来。

本实验所有试剂在有效范围内均无荧光干扰。

1.5统计方法实验结果以X±s表示；组间和同组用药前后的［Ca²⁺］_i差异用t检验。药物对ATP触发Ca²⁺内流的抑制率按下列公式计算：

2结果

2.1牛主动脉内皮细胞的鉴定在相差显微镜下，内皮细胞长满整瓶后呈典型的铺路石状，并有接触抑制现象。免疫组化实验发现，98%以上细胞第Ⅷ因子相关抗原反应阳性，证明是血管内皮细胞。

2.2ATP触发的牛主动脉内皮细胞［Ca²⁺］_i变化在含1.5 mmol·L^-1 CaCl₂的HBSS中，ATP(0.1～100 μmol·L^-1)浓度依赖性地升高牛主动脉内皮细胞［Ca²⁺］_i(数据未示)，100 μmol·L^-1 ATP引起的［Ca²⁺］_i升高分为两相：由静息期的(42±18) nmol·L^-1快速升高到(585±133) nmol·L