中华实验外科杂志2000年第17卷第3期

耿庆高尚志

摘要目的研究兔未成熟心肌的成熟时限及其特性。方法分别以1、3、5、7、16、24周龄正常兔心肌为对象，每组10只，从形态结构、钙代谢、能量代谢、氧自由基代谢、内分泌功能及其基因表达等方面进行研究。结果正常兔未成熟心肌结构、功能有其特点，随周龄增长主要变化多发生在3～7周龄，至7周龄时绝大多数研究指标趋于成熟，各指标成熟时间先后不一，心肌基本成熟时间早于性成熟期。结论正常未成熟心肌结构、功能约在7周龄左右基本接近成熟，早于性成熟期。

关键词：未成熟心肌成熟心肌

我们通过动物实验，观察兔出生后的未成熟心肌增龄性变化，确定未成熟心肌的成熟时限，并研究其特性，现将结果报道如下。材料与方法

1.实验对象：以健康中国大耳白兔为研究对象，按周龄分为6组：1、3、5、7、16、24周各为1组，每组各10只兔，雌雄不拘。

2.实验方法：腹腔内注射戊巴比妥钠(50 mg/kg体重)后，迅速取出心脏，取心房肌及数块心室肌标本，分别测定心肌内分泌功能及形态结构、物质代谢、基因表达。

3.观察内容及监测指标：(1)形态结构：光镜、电镜观察后用MPIAS-1000型多媒体图像分析系统进行如下指标的立体计量学测量：心肌细胞直径、肌节长度、浆核比、肌原纤维体密度(Vv)、线粒体体密度(Vv)、面数密度(Na)、比表面(δ)、心肌间质面积百分比、心肌毛细血管密度。(2)物质代谢：测定心肌超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量；心肌Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺含量；应用差速离心法提取线粒体、肌浆网粗制膜，测定其Ca²⁺-ATP酶活性及其Ca²⁺含量；心肌乳酸脱氢酶(LDH)、激酸激酶(CK)活性、α-羟丁酸脱氢酶/乳酸脱氢酶(α-HBDH/LDH)比值及乳酸(LA)含量；荧光素酶法测心肌ATP含量，Winifred法测心肌线粒体合成ATP能力及其CK活性；对氨基水杨酸(PAS)法显示心肌糖原并用图像分析法测定其平均吸光度表示相对含量。(3)放射免疫法测定心肌血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、心钠素(ANP)含量。(4)心肌细胞增殖能力：①Feulgen法显示心肌细胞DNA，用图像分析法进行DNA倍性分析；②心肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)mRNA及原癌基因c-myc mRNA原位杂交：PCNA免疫组织化学、bFGF、c-myc原位杂交检测试剂盒为博士德生物工程公司产品。光镜观察后用图像分析法测定其平均吸光度表示相对含量。

4.统计学处理：采用t检验、相关回归分析。

结果

1.超微结构：(1)与周龄呈正相关：心肌细胞直径(r=0.6896,P＜0.01);心肌细胞浆核比(r=0.735 0,P＜0.01)；心肌细胞肌原纤维Vv(r=0.6825,P＜0.01)；心肌细胞线粒体Vv、Na(r分别为0.772 9和0.519 6，P均＜0.05)。(2)与周龄呈负相关：心肌毛细血管密度(r=-0.2819,P＜0.05)。(3)与周龄无关：心肌细胞肌节长度(r=-0.184 2,P＞0.05)；心肌细胞线粒体δ(r=0.0887,P＞0.05);心肌间质面积百分比(r=-0.243 9,P＞0.05)。

2.物质代谢：(1)心肌SOD活性与周龄呈负相关(r=-0.752 2,P＜0.01)；而MDA含量则与周龄呈正相关(r=0.7366,P＜0.01)；(2)心肌Na⁺、K⁺含量与周龄无关(r分别为-0.1681和-0.178 1,P＞0.05)；Ca²⁺含量与周龄呈正相关(r=-0.699 8,P＜0.01)；Mg²⁺含量与周龄呈负相关(r=-0.4888,P＜0.05)；(3)心肌肌浆网Ca²⁺-ATPase活性及Ca²⁺含量与周龄呈正相关(r分别为0.6402和0.683 5,P＜0.01)，线粒体Ca²⁺-ATPase活性及Ca²⁺含量与周龄呈负相关(r分别为-0.7761和-0.674 4,P＜0.01)；(4)心肌LA、ATP及糖原含量与周龄呈负相关(r分别为-0.7746、-0.611 0和-0.721 4，P＜0.01)；心肌LDH、CK活性及α-HBDH/LDH比值与周龄呈正相关(r分别为0.5979、0.863 3和0.669 7，P＜0.05)；心肌线粒体合成ATP能力及CK活性均与周龄呈正相关(r分别为0.7945和0.741 9,P＜0.01)。

3.心脏内分泌功能：心肌AngⅡ、ANP含量与周龄呈负相关(r分别为-0.5213和-0.408 3,P＜0.05)。

4.心肌细胞增殖能力：(1)心肌细胞DNA倍性分布：心肌细胞二倍体与周龄呈负相关(r=-0.7834,P＜0.01)，而四倍体与周龄呈正相关(r=-0.688 9,P＜0.01)，5周龄开始出现少量八倍体。(2)心肌细胞PCNA蛋白定位于心肌细胞核，呈棕黄色细颗粒。其平均吸光度均随周龄增长显著降低，3周龄以后各组无PCNA表达。(3)心肌细胞bFGF mRNA定位于胞浆，呈棕黄色颗粒。出生至5周龄心肌细胞bFGF mRNA表达随周龄增长其平均吸光度显著减少，在以后各组心肌细胞无阳性表达，但在间质中偶有弱阳性表达。(4)心肌细胞c-myc mRNA定位于胞浆，呈棕黄色颗粒状分布。随周龄增长，c-myc mRNA阳性表达平均吸光度显著下降，3周龄以后各组无阳性表达。

讨论

随周龄增长，正常兔心肌结构、功能逐渐发育成熟。未成熟心肌作为心肌发育学上一个独特的阶段，其结构、功能有其特点。未成熟心肌细胞小，胞内肌原纤维含量少，分布较为疏松，非收缩性成分所占比重大，线粒体少、体积小、嵴发育不全，肌浆网稀疏，T管密度低，质膜面积与细胞容积比值高。未成熟心肌收缩力弱，心肌顺应性差，功能储备低，几乎为最大变肌力状态。未成熟心肌细胞钙调节系统尚未发育成熟，膜系统发育不完善，钙泵活性低，Ca²⁺向肌浆网内主动转运速度慢，胞内Ca²⁺储备少，其兴奋收缩偶联主要依赖细胞外Ca²⁺的参与^［1］。未成熟心肌糖原颗粒丰富，糖原分解和无氧酵解能力强，其能量主要来源于葡萄糖或糖原的有氧分解和无氧酵解，未成熟心肌苹果酸/天门冬氨酸穿梭能力强^［2］。未成熟心肌SOD活性高，其抗自由基损伤、抗氧化能力强。

我们的研究结果表明，正常兔未成熟心肌结构、功能约在7周龄左右基本趋于成熟。各观察指标成熟时限先后不一，其中结构成熟稍早于功能成熟。心肌基本成熟时间早于性成熟期。鉴于未成熟心肌在结构、功能的特点，未成熟心肌保护有其特殊性，其心肌停搏液应采用适宜的温度、Ca²⁺浓度、能量底物以及灌注次数、压力以增强其心肌保护效果^{［2，3］。}

基金项目：湖北省自然科学基金资助项目(96J074)

作者单位：耿庆（430060武汉，湖北医科大学附属第一医院胸心外科现在深圳市中心医院胸心外科，518036）

高尚志（430060武汉，湖北医科大学附属第一医院胸心外科）

参考文献

［1］刘风华，高尚志.未成熟与成熟心肌形态结构及生理功能的研究现状.中华胸心血管外科杂志，1999，15：55-57.

［2］Weldner PW,Myers JL,Miller CA, et al.Improved recovery of immature myocardium with L-glutamate blood cardioplegia.Ann Thorac Surg,1993,55:102-105.

［3］黄杰，高尚志，程邦昌，等.不同温度下停搏液对成熟与未成熟心肌的保护作用.中华实验外科杂志，1997，14：302-303.