中华血液学杂志2000年第21期第3期

邹静张启良

摘要目的：比较凝血酶对培养的人血管内皮细胞（VEC）和U937细胞表达组织因子（TF）和尿激酶型纤溶酶原激活剂受体（uPAR）mRNA的影响，并探讨其机制。方法：在凝血酶、无活性的凝血酶(DFP-T)和(或)抗凝血酶受体(TR)14肽多抗作用下，以RT-PCR法测定培养细胞TF和uPAR mRNA，进行分析比较。结果：TR抗体能完全阻断凝血酶诱导U937细胞表达TF和uPAR mRNA；对VEC的作用并不完全。DFP-T对U937细胞无诱导作用；对VEC有低水平的诱导作用。结论：凝血酶诱导TF和uPAR mRNA表达的机制主要与其和细胞膜上TR结合并激活TR有关，在VEC可能存在TR以外的其他作用途径。

关键词：血管内皮细胞细胞系，U937组织因子凝血酶受体，尿激酶

血栓形成多见于心、脑血管疾病，又是恶性肿瘤中常见的并发症，恶性肿瘤患者80%以上可有实验室出、凝血指标的异常^［1］。正常血管内皮细胞(VEC)有很强的抗凝作用，其表面结合的激肽能使单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA，pro-UK）转化为高活性双链uPA（tcu-PA）。膜上uPA受体(uPAR)能调节uPA的纤溶活性。VEC尚具有潜在的促凝作用。膜上组织因子(TF)作为FⅦ/Ⅶa的辅因子，激活FⅩ和FⅨ，是体内主要的生理性凝血激活因子。资料表明，TF在胚胎发生和肿瘤组织血管生成过程中具有决定性作用^［2］；纤溶系统功能在内皮细胞移行和血管增生时也有重要作用^［3］。

我们以凝血酶为刺激物，研究其对VEC和U937细胞TF及uPAR mRNA表达的影响及其机制，以阐明凝血酶、抗凝血酶受体(TR)、TF与uPAR的相互关系以及不同类型细胞可能存在的差异。

材料和方法

1材料U937细胞购自北京军事医学科学院。二异丙基氟磷酸（DFP）、匙孔槭血蓝蛋白（KLH）、Ⅰ型胶原酶为Sigma公司产品。RPMI 1640和M199培养基、Trizol试剂、鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV）购自Gibco/BRL公司。小牛血清购自四季青公司。Taq DNA聚合酶购自Sangon公司。TR短肽由中国科学院上海细胞所合成。

2方法

2.1细胞培养：①VEC培养：24h内的新鲜人脐带以1g/L Ⅰ型胶原酶消化取VEC，用M199完全培养液在体积分数为5%的CO₂、37℃恒温培养。隔天换液，观察生长情况。待细胞完全融合后1～2d进行实验或传代培养。②U937细胞培养：用RPMI 1640完全培养液在上述条件下培养，在密度达5×10⁵/ml以上、活细胞率大于90%时进行实验。

2.2无活性凝血酶（DFP-T）制备：50μmol/L凝血酶10μl加入1.0ml含2.65mgDFP的0.1mol/L Tris缓冲液，37℃反应2小时, 加同量DFP作重复处理，透析后保存。用正常人血浆作凝固试验，凝血酶终浓度200nmol/L时，血浆在8～12s内凝固，同浓度DFP-T不能使血浆凝固（＞2min）。

2.3抗凝血酶受体（TR）短肽兔抗体制备：合成TR水蛭素样结构域^［4］中的14肽（KYEPFWEDEEK-NES），按Brown的方法^［5］以5mg短肽与10mg KLH交联。首次用300μg KLH-TR肽配以佐剂，以背部多点注射法免疫新西兰纯种兔。3～4周后加强免疫（KLH-TR短肽200 μg/次）共4～5次。抗TR短肽抗血清用蛋白A柱纯化抗体；由正常兔血清纯化的IgG在实验中作对照。

2.4测定TF/uPAR mRNA的RT-PCR方法：收集5×10⁶待测细胞，由细胞抽提的总RNA经紫外分光光度计比色定量。取2.0 μg RNA经逆转录合成第一链cDNA，用1/10反应物作PCR。内参照管家基因β-actin上游引物：5′-GCGGGAAATCGTGCGTGAC-ATT-3′；下游引物：5′-GATGGAGTTGAAGGTAGTT-TCGTG-3′，扩增条带为305bp。TF上游引物：5′-GGATGTGAAGCAGACGTACT-3′；下游引物：5′-GTGTAGAGATATAGCCAGGA-3′， 扩增产物为535bp 。扩增条件95℃、56℃和72℃各60s，35个循环。uPAR上游引物：5′-CTGCGGTGCATGCAG-3′；下游引物：5′-CACAACCTCGGTAAG-3′，扩增产物210bp。反应条件为94℃ 90s，50℃ 90s，72℃ 60s，35个循环。PCR产物经20g/L琼脂糖电泳后作图象分析，读取各条带辉度。根据TF/uPAR与β-actin条带辉度的比值计算mRNA的相对含量，分析TF/uPAR mRNA的水平。

2.5RT-PCR方法稳定性的估价：4批不同时间取材的VEC作相同实验，均分对照和0.05，0.50，1.00及10.00nmol/L 四种凝血酶浓度共5组，刺激细胞1h后以RT-PCR测定TF/uPAR mRNA，对4批结果作批间变异系数（CV间）分析。

2.6分组实验的方法：①0～30nmol/L共11种浓度凝血酶分别刺激VEC 和U937细胞1h；②0.5nmol/L凝血酶刺激VEC 0～24h，分10个时相取样；③0.5nmol/L凝血酶刺激U937细胞1h，加用缓冲液或10μg/ml放线菌素D分别作用0.5,1.0,2.0和4.0h；④U937细胞以100μg/ml抗TR抗体作用1h，换以0.5nmol/L凝血酶或DFP-T刺激4h；⑤VEC以25～400μg/ml抗TR抗体作用1h，换以0.5nmol/L凝血酶或DFP-T刺激4h。各组抽提RNA，以RT-PCR分析TF及uPAR mRNA。

结 果

1对RT-PCR方法可靠性的评价静息VEC的TF或uPAR mRNA的表达量都极其低微，不同剂量凝血酶刺激使TF及uPAR mRNA表达明显增高。分析不同浓度凝血酶刺激后TF和uPAR mRNA相对含量(x±s，n=4），TF分别为2.66±0.14,3.71±0.17,3.22±0.14和2.41±0.07；uPAR为0.80±0.03,1.05±0.04,1.23±0.04和0.85±0.03。4批间变异系数（CV间）在3%～5%之间（图1）。

c:未受刺激细胞；1：0.05nmol/L凝血酶刺激1h；2：0.50nmol/L

凝血酶刺激1h；3：1.00nmol/L凝血酶刺激1h；4：10.00nmol/L

凝血酶刺激1h

图1VEC和U937细胞RT-PCR产物凝胶电泳结果

2凝血酶对VEC和U937细胞TF及uPAR mRNA表达的影响

2.1不同浓度凝血酶对VEC和U937细胞TF及uPAR mRNA表达的影响：凝血酶对VEC的TF和uPAR mRNA表达的促进作用均存在一定的浓度依赖关系，对TF mRNA的表达促进作用较强；未受刺激的U937细胞可明显表达一定量TF及uPAR mRNA，凝血酶能进一步促进其TF和uPAR mRNA的表达（图2，图中以未受刺激细胞表达量为1，以“mRNA增幅”表示mRNA增加的量）。

图2不同浓度凝血酶对VEC和U937细胞 TF及uPAR mRNA表达的影响

2.2凝血酶作用时间对VEC的TF和uPAR mRNA表达的影响：凝血酶刺激时间与两种mRNA表达量明显相关，同一浓度凝血酶使TF和uPAR mRNA表达达峰值的时相有所差别（图3）。

图3凝血酶刺激时间对VEC TF及uPAR mRNA表达的影响

3放线菌素D、抗TR抗体等对凝血酶作用的影响 3.1U937细胞中放线菌素D对凝血酶作用的影响：放线菌素D对凝血酶促进TF和uPAR mRNA表达有抑制作用，且这种抑制作用随放线菌素D的作用时间延长而增强（图4）。

图4放线菌素D作用不同时间对凝血酶促U937细胞TF和uPAR mRNA表达的影响

3.2U937细胞中抗TR抗体对凝血酶作用的影响：抗TR抗体能完全阻断凝血酶促进细胞表达TF及uPAR mRNA。DFP-T对U937细胞TF和uPAR mRNA的表达无明显影响（图5）。

1：对照组；2：凝血酶(T)刺激组；3：DFP-T刺激组；4：正常兔IgG 100μg/ml+T刺激组；5：抗TR抗体100μg/ml+T刺激组；6：抗TR抗体100μg/ml+DFP-T组

图5凝血酶对U937细胞TF及uPAR mRNA表达的影响

3.3VEC中抗TR抗体对凝血酶作用的影响：与正常兔IgG相比，抗TR抗体对凝血酶促进VEC两种mRNA的表达具有抑制作用，但这种作用并不完全，即使在大剂量抗体（400 μg/ml）作用下，也不能完全阻断凝血酶对两种mRNA表达的促进作用。无活性的DFP-T也存在对VEC两种mRNA表达的刺激作用，但与同浓度凝血酶相比，其作用明显较弱；100 μg/ml抗TR抗体也不能完全阻断DFP-T的上述作用（图6）。

1：对照，VEC+缓冲液;2:单纯T刺激组；3：DFP-T刺激组；4：正常兔IgG(100μg/ml)+T组；5～8：分别为400，100，50，25μg/ml TR抗体+T组；9：100μg/ml TR抗体+DFP-T组

图6凝血酶对VEC TF 及uPAR mRNA表达的影响